【摘要】： 海洛因海綿狀白質腦病(heroin spongiform leukoencephalopathy HSLE)是指經(jīng)鼻燙吸海洛因干餾物后出現(xiàn)的以腦白質海綿狀空泡變性為病理特征,以小腦性共濟失調為主要癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)器質性疾病。1982年Wolters E在荷蘭阿姆斯特丹首次報道47例。2000年陸兵勛教授等首次在我國報道28例HSLE患者。目前世界多個國家和地區(qū)均有個案報道。影像學檢查發(fā)現(xiàn)HSLE呈廣泛對稱性白質病變,以小腦半球、內囊后肢、胼胝體壓部及頂枕葉白質易受損。腦脊液檢查堿性髓鞘蛋白(myelin bases protein MBP)增高。其發(fā)病可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘有關。單獨靜脈注射海洛因者未發(fā)現(xiàn)HSLE發(fā)病。從零售的海洛因粉劑中已鑒定出大量攙雜物,如安定、異煙肼、滑石粉等物質,推測可能是某種攙雜物引起HSLE,而不是海洛因本身。但病因和發(fā)病機制不清。有研究證實多種因素均可引起腦白質脫髓鞘和少突膠質細胞凋亡,最終導致軸突脫髓鞘及傳導性能喪失。調節(jié)細胞凋亡因子bcl-2/bax比值減少可能直接導致神經(jīng)元凋亡通路。環(huán)己銅草酰二腙可引起腦白質脫髓鞘改變,并具有明顯的區(qū)域分布,胼胝體壓部及后穹隆病灶明顯,而胼胝體膝部及前小腦腳則沒有明顯的脫髓鞘改變。本研究以影像學及神經(jīng)病理學分析HSLE腦白質脫髓鞘及腦水腫特征,用海洛因攙雜物及環(huán)己銅草酰二腙探索制備大鼠腦白質改變模型,并與HSLE相比較,從少突膠質細胞凋亡及調控因子bcl-2/bax著手,研究HSLE腦水腫特征及少突膠質細胞凋亡的發(fā)病機制。 1海洛因海綿狀白質腦病影像學及神經(jīng)病理特征研究 1.1研究目的 通過MRI檢查、HE染色和MBP免疫組化方法,研究和探討HSLE脫髓鞘和海綿狀空泡變性特征。 1.2研究方法 HSLE住院患者6例(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院),頭顱MRI采集T1WI、T2WI、水抑制、增強及MRA影像,綜合分析腦部病變定位、定性及腦血管改變情況。 4例HSLE尸檢腦組織,5例正常對照腦組織(來源于非腦部病變死亡尸檢病例)。HE染色、MBP免疫組化及透射電鏡檢測腦白質脫髓鞘、空泡變性及超微結構特征。 1.3研究結果 1.3.1頭顱MRI檢查 大腦皮質變薄,腦白質擴大,病灶周邊無明顯腦水腫,無明顯占位效應。6例患者均存在小腦白質、胼胝體壓部、內囊后支及枕葉白質病灶。病灶呈長T1WI、長T2WI。雙側大腦FLAIR像病灶呈高信號,較T2WI稍減低,增強無強化。MRA顯示各主干動脈纖細,分支減少,與臨床癥狀嚴重程度成正比。 1.3.2透射電鏡 HSLE腦白質脫髓鞘改變,少突膠質細胞多發(fā)性空泡變性,在其殘留的胞漿中可見腫脹的線粒體及膨脹的內質網(wǎng)。 1.3.3 HE染色 HSLE患者腦白質疏松,大腦白質、小腦白質、胼胝體空泡形成,沿軸索走行。大腦白質由淺層到深層,空泡樣改變逐漸明顯,結構散亂。小腦顆粒下層白質空泡較大,向深層白質空泡漸小而密集。白質血管周圍空泡形成明顯。皮質下白質、胼胝體軸索腫脹,細胞核分散。 1.3.4 MBP染色 髓鞘染色成棕褐色,大腦白質、小腦白質及胼胝體染色淺,染色不均,空泡樣無著色區(qū)由淺層到深層逐漸增多、加重,髓鞘纖維斷裂、崩解,白質疏松。 1.4研究結論 (1)HSLE白質病變區(qū)影像學髓鞘明顯減少; (2)HSLE形態(tài)學腦白質脫髓鞘和空泡變; (3)HSLE存在血管痙攣及繼發(fā)性微循環(huán)改變; (4)HSLE白質空泡變性與血管改變有關。 2 bcl-2/bax基因表達和少突膠質細胞凋亡在海洛因海綿狀白質腦病發(fā)病機制中的作用研究 2.1研究目的 檢測HSLE腦組織細胞凋亡及其調節(jié)因子,研究HSLE少突膠質細胞凋亡的發(fā)病機制 2.2研究方法 4例HSLE尸檢腦組織,5例正常對照腦組織(來源于非腦部病變死亡尸檢病例)。檢測大腦白質、小腦白質和胼胝體區(qū)TUNEl陽性細胞、caspase-3陽性表達及bcl-2/bax基因表達并計數(shù),統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件包,各陽性細胞數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x~-±s)表示,病例組與對照組不同腦區(qū)比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析,多重比較采用LSD方法,相同腦區(qū)兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,TUNEL細胞凋亡計數(shù)與caspase-3表達之間的關系采用-Pearson相關檢驗。 2.3研究結果 2.3.1 TUNEL細胞凋亡檢測 HSLE患者大腦白質有少量凋亡陽性細胞,小腦白質、胼胝體部位大量細胞核呈棕褐色,深染不均,計數(shù)明顯高于對照組,與對照組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(F=327.913,P=0.000);部位間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=68.100,P=0.000),部位間多重比較,小腦白質與胼胝體之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.310),大腦白質與小腦、胼胝體比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018,P=0.017);兩組不同腦區(qū)之間交互效應具有統(tǒng)計學意義(F=83.715,P=0.000)。 2.3.2 Caspase-3免疫組化陽性表達 caspase-3陽性細胞廣泛存在于HSLE大腦、小腦和胼胝體白質,以病灶中心部位為最明顯,在邊緣區(qū)及相對病變程度輕的額葉,也有少量細胞凋亡。兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=387.955,P=0.000);部位間比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(F=215.727,P=0.000),部位間多重比較,小腦白質與胼胝體之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.096),大腦白質與小腦白質(P=0.020)、胼胝體(P=0.022)比較差異有顯著統(tǒng)計學意義;TUNEL陽性計數(shù)與caspase-3陽性計數(shù)之間存在正相關(pearson r=0.924,P=0.000)。腦白質主要由少突膠質細胞形成髓鞘,表明HSLE腦白質存在廣泛大量少突膠質細胞凋亡。 2.3.3 Bcl-2基因表達 HSLE與對照組間比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.001,P=0.978),大腦白質、小腦白質及胼胝體部位間比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.001,P=0.999)。 2.3.4 Bax基因表達 兩組間比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(F=11.098,P=0.013),HSLE部位間比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(F=5.632,P=0.016),部位間多重比較,小腦白質與胼胝體之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.952),大腦白質與小腦白質(P=0.032)、胼胝體(P=0.035)比較差異有顯著統(tǒng)計學意義。Bcl-2為促生存家族,bax為促凋亡家族,HSLE腦白質bax表達增高與細胞凋亡有關,Bax高表達使線粒體細胞色素C釋放,致使Caspases-9和Caspases-3激活而誘導凋亡,Bax與Bcl-2的相對比值在決定細胞生存或死亡中可能起關鍵作用。 2.4研究結論 (1)少突膠質細胞凋亡是脫髓鞘的原因; (2)TNF受體1結合后激活caspase-3導致少突膠質細胞凋亡; (3)Bcl-2/Bax比值減少促使少突膠質細胞凋亡。 3環(huán)己銅二腙誘導大鼠腦白質空泡樣變性特征及少突膠質細胞凋亡研究 3.1研究目的 通過探索并建立腦白質海綿狀空泡變性模型,進一步研究其病因及發(fā)病機制,為HSLE病因及發(fā)病機制研究提供新的研究內容和思路。 3.2研究方法 SD大鼠72只,動物分組:攙雜物煙熏組(攙熏組)、攙雜物喂食組(攙喂組)、環(huán)己銅二腙組(銅腙組)、生理鹽水組(對照組),每組分2周、4周、6周3個時間段,每時間段6只SD大鼠。攙雜物按安定:苯巴比妥:異煙肼:水合硅酸鎂=2.5∶30∶100∶200的比例研磨成粉備用。攙雜物混合粉劑染毒量每次25mg/100g體重。銅腙組將環(huán)己銅二腙配制成1%混懸液,按10mg/100g體重經(jīng)口灌胃;對照組予等量生理鹽水灌胃。均為1次/日。制備SD大鼠腦白質空泡變性膜型,在相應時間點腦組織取材、固定。 HE染色、MBP免疫組化髓鞘染色檢測腦白質脫髓鞘及空泡變性特征;透射電鏡觀察胼胝體壓部超微結構;TUNEL技術及caspase-3免疫組化檢測細胞凋亡。 統(tǒng)計學方法:應用SPSS 13.0軟件包,TUNEL及caspase-3陽性細胞數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x~-±s)表示,各組相同腦區(qū)及不同時間點之間進行析因方差分析。 3.3研究結果 3.3.1實驗鼠大體腦標本 72例SD大鼠腦表面灰白色,無充血、腫脹,各組大體觀察無明顯差異。 3.3.2 HE染色 攙熏組、攙喂組、銅腙2、4周組及對照組大、小腦結構正常,白質內未見空泡樣改變。銅腙6周組可見大鼠腦白質空泡形成,空泡呈長條形或橢圓形,沿纖維走行,以腦干和枕頂葉白質空泡樣改變最明顯,血管無明顯改變,血管周圍無明顯空泡,無明顯炎細胞浸潤,未見壞死區(qū),未見明顯膠質細胞增生,大腦灰質神經(jīng)細胞和小腦灰質Purkinje細胞未見缺失和變性。 3.3.3透射電鏡 銅腙4周組大鼠,可見髓鞘排列較紊亂,部分結構松解變性,但無典型脫髓鞘改變,銅腙6周組大鼠腦胼胝體可見髓鞘腫脹,髓鞘板層內有空泡形成。 3.3.4 MBP免疫組化染色 攙熏組、攙喂組、銅腙2、4周組及對照組大鼠腦白質、胼胝體染色均勻,未見組織疏松、空泡形成等改變。銅腙6周組可見大鼠腦白質淡染、稀疏,髓鞘中斷或被擠向兩側,出現(xiàn)無著色空泡,以腦干和頂枕葉白質最明顯。 3.3.5 TUNEL染色 銅腙2周組腦白質偶見散在細胞凋亡,銅腙4周組可見腦白質較多凋亡陽性細胞,深染不均,銅腙6周組可見腦室周白質、小腦白質、胼胝體及腦干部位大量凋亡細胞,分布在空泡區(qū),各組TUNEL計數(shù)比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義(F=309.934,P=0.000),不同時間之間相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義(F=163.839,P=0.000),各組不同時間交互效應有顯著統(tǒng)計學意義(F=155.270,P=0.000),銅腙組與攙熏組、攙喂組及對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000),6周組與2周組、4周組比較均有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000),4周組與2周組比較具有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000),以銅腙6周組最高,其次為銅腙4周組,其余各組及各時間之間差異無統(tǒng)計學意義。提示銅腙4周組腦白質已出現(xiàn)細胞凋亡,隨著時間延長,到6周時細胞凋亡加重。 3.3.6 caspase-3免疫組化 銅腙4周組可見腦白質較多凋亡陽性顆粒,深染不均,銅腙6周組可見皮質下白質、小腦白質、胼胝體及腦干部位大量凋亡細胞,分布在腦白質空泡區(qū),各組之間差異具有顯著統(tǒng)計學意義(F=84.018,P=0.000),不同時間之間差異具有顯著統(tǒng)計學意義(F=23.611,P=0.000),銅腙組與攙熏組、攙喂組及對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.000),6周組與2周組、4周組比較均有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.000),4周組與2周組比較有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.003),以銅腙6周組最高,其次為銅腙4周組,其余各組及各時間之間差異無統(tǒng)計學意義。提示銅腙4周組腦白質出現(xiàn)細胞凋亡信號,隨著時間延長,到6周時細胞凋亡加重。與TUNEL凋亡染色相一致,與HE染色及MBP髓鞘染色形態(tài)學損害區(qū)相一致。說明細胞凋亡與腦白質海綿狀空泡變性有關,細胞凋亡可能為腦白質海綿狀空泡變性的原因之一。 3.4研究結論 (1)安定、苯巴比妥、異煙肼、水合硅酸鎂混合物煙熏或喂食未致鼠脫髓鞘和空泡變; (2)海洛因攙雜物未引起SD鼠白質細胞凋亡; (3)鼠經(jīng)口攝入銅腙主要損害靶點在CNS少突膠質細胞,其凋亡致空泡樣變; (4)銅腙喂食致SD鼠腦白質脫髓鞘及空泡變性,無血管相關性; (5)出現(xiàn)細胞凋亡(4W)早于出現(xiàn)腦白質脫髓鞘和空泡變性(6W),細胞凋亡是脫髓鞘及空泡變的先導; (6)細胞凋亡與脫髓鞘、空泡形成有關,呈時間劑量相關性,隨銅腙攝入時間延長、總劑量增加,細胞凋亡增多。 4全文總結 (1)HSLE白質病變區(qū)影像學髓鞘明顯減少; (2)HSLE形態(tài)學腦白質脫髓鞘和空泡變; (3)HSLE存在血管痙攣及繼發(fā)性微循環(huán)改變; (4)HSLE白質空泡變性與血管改變有關; (5)少突膠質細胞凋亡是脫髓鞘的原因; (6)TNF受體1結合后激活caspase-3導致少突膠質細胞凋亡; (7)Bcl-2/Bax比值減少促使少突膠質細胞凋亡; (8)安定、苯巴比妥、異煙肼、水合硅酸鎂混合物煙熏或喂食未致鼠脫髓鞘和空泡變; (9)海洛因攙雜物未引起SD鼠白質細胞凋亡; (10)鼠經(jīng)口攝入銅腙主要損害靶點在CNS少突膠質細胞,其凋亡致空泡樣變; (11)銅腙喂食致SD鼠腦白質脫髓鞘及空泡變性,無血管相關性; (12)出現(xiàn)細胞凋亡(4W)早于出現(xiàn)腦白質脫髓鞘和空泡變性(6W),細胞凋亡是脫髓鞘及空泡變的先導; (13)細胞凋亡與脫髓鞘、空泡形成有關,呈時間劑量相關性,隨銅腙攝入時間延長、總劑量增加,細胞凋亡增多。
【圖文】：

博士學位論文圖2一 1HSLE與對照組不同腦區(qū)TUNEL陽性細胞計數(shù)交互效應輪廓圖 F19.2一 1profilPlotofTUNEL一 Positivecellseountindifferent brainregionsofHSLEandthecontrolgrouPl一fro;2一eb;3一eeEs廿ma愧 dMa勺 inalMeansofMEASURE_130.0()g1DUP-----以:.一~一叫I25.0020.0() 15.0() 10.()()趁 l!Z

HSLE與對照組bcl一在不同腦區(qū)免疫組化染色(%40)A,C.E分別為HSLE組
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R749.89

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本文編號：2693553