【摘要】： 隨著突發(fā)性災(zāi)難事件的增多,創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。PTSD的本質(zhì)是一系列與創(chuàng)傷事件相關(guān)的記憶(條件性恐懼),創(chuàng)傷性記憶一旦形成,很難自然消失,嚴(yán)重影響日常生活。暴露療法的原理是創(chuàng)傷記憶的消退,但其對(duì)PTSD的療效難以維持,表現(xiàn)為已消退的恐懼記憶又很快再現(xiàn)。提示消退保持(extinction retention)障礙可能是創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)生和治療困難的關(guān)鍵。既往實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medial prefrontal cortex,mPFC)邊緣下區(qū)(infralimbic area,IL)與PTSD發(fā)生、發(fā)展和治療結(jié)局密切相關(guān),然而,其在條件性恐懼消退保持中的作用和機(jī)制尚不清楚。 我們?cè)谝酝鶎W(xué)者研究的基礎(chǔ)上,綜合行為藥理學(xué)、形態(tài)學(xué)以及Western Blot方法探索條件性恐懼記憶消退的最佳“時(shí)間窗”,探討IL區(qū)在條件性恐懼記憶消退保持中的作用及其機(jī)制,為提高并鞏固PTSD治療效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為達(dá)成這一目的,設(shè)計(jì)了以下3個(gè)實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)一不同消退方式后條件性恐懼大鼠消退保持的動(dòng)態(tài)觀察 目的:探討條件性恐懼大鼠經(jīng)歷不同消退訓(xùn)練后,消退記憶保持水平的動(dòng)態(tài)變化。 方法:條件刺激(聲音)與非條件刺激(不可逃避的足底電擊)配對(duì)呈現(xiàn)建立條件性恐懼;隨后重復(fù)呈現(xiàn)單獨(dú)的條件刺激用于消退訓(xùn)練。48只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(自然消退,Cont組),大鼠建立聲音提示的條件性恐懼而不進(jìn)行消退訓(xùn)練;立即消退組(Imme EXT),建立條件性恐懼后15min進(jìn)行消退訓(xùn)練;延遲消退組(EXT組),建立條件性恐懼后24h進(jìn)行消退訓(xùn)練。以上三組大鼠一半于建模后第1、3、7、20天測(cè)試僵立行為(大鼠連續(xù)10min內(nèi)僵立時(shí)間百分比);另一半分別于消退后第1、3、7、20天通過(guò)高架十字迷宮測(cè)試焦慮行為。 結(jié)果:①Cont,Imme EXT和EXT組僵立行為基礎(chǔ)值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。EXT組的消退效果好于Imme EXT和Cont組(P0.001),其遠(yuǎn)期消退效果持續(xù)穩(wěn)定;EXT組大鼠消退后第1、3天的僵立行為顯著下降(P0.01),第7天已接近正常水平。Imme EXT組和Cont組間消退效果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。各組大鼠在消退后7-20天僵立行為的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 ②Cont,Imme EXT和EXT組的開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)百分比(OA time%)和開(kāi)放臂停留時(shí)間百分比(OA time%)基礎(chǔ)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05);在消退后不同時(shí)間點(diǎn),OA entries%和OA time%兩個(gè)指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�？傮w來(lái)說(shuō),各組動(dòng)物隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)延長(zhǎng)其焦慮水平逐漸降低,但各組之間在同一時(shí)間點(diǎn)上的焦慮水平的改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。 結(jié)論:不同的消退訓(xùn)練方式對(duì)條件性恐懼大鼠的遠(yuǎn)期消退效果不同,延遲消退訓(xùn)練方式效果最好。同時(shí),由于不同處理組大鼠的焦慮水平類(lèi)似,排除了立即消退組僵立評(píng)分值較高是焦慮水平升高所致。 實(shí)驗(yàn)二條件性恐懼消退保持過(guò)程中IL區(qū)磷酸化CREB的動(dòng)態(tài)變化 目的:探討條件性恐懼大鼠經(jīng)歷不同消退訓(xùn)練后,消退記憶保持過(guò)程中,IL區(qū)pCREB的變化。 方法:實(shí)驗(yàn)一觀察到條件性恐懼延遲消退訓(xùn)練效果好于立即消退訓(xùn)練,且消退后1-3天的消退效果最為明顯。本實(shí)驗(yàn)采用聲音-足底電擊配對(duì)(條件恐懼)或非配對(duì)(非條件恐懼)刺激后,使用延遲消退方式訓(xùn)練大鼠,比較非條件恐懼和條件恐懼延遲消退后大鼠僵立行為變化和IL區(qū)pCREB的表達(dá)不同,同時(shí)觀察條件恐懼延遲消退組在消退后1、3、7天IL區(qū)信號(hào)分子pCREB的動(dòng)態(tài)變化。將SD雄性成年大鼠隨機(jī)分為5組:空白組(Naive組,無(wú)任何處理),假訓(xùn)練A組(Sham A,聲音和足底電刺激不配對(duì)呈現(xiàn)),假訓(xùn)練B組(Sham B,僅有足底電刺激),條件性恐懼組(Cont組,無(wú)消退訓(xùn)練),延遲消退組(EXT組)。除Cont組外,其余各組均采用與實(shí)驗(yàn)一相同的延遲消退訓(xùn)練方式,在消退后24h取材; EXT組在延遲消退后不同時(shí)間點(diǎn)(消退后1、3、7天)取材;各組均采用免疫熒光染色及Western Blot定位和半定量檢測(cè)目標(biāo)蛋白pCREB的表達(dá)水平(3-4只大鼠/時(shí)間點(diǎn))。免疫熒光單一標(biāo)記各組IL區(qū)pCREB以說(shuō)明非條件恐懼對(duì)IL區(qū)細(xì)胞pCREB表達(dá)的影響。免疫熒光三重標(biāo)記分別指:pCREB顯示細(xì)胞核(綠),Neu-N顯示神經(jīng)元胞體和胞核(紅),hoechst染色細(xì)胞核(藍(lán))。pCREB陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)為Neu-N陽(yáng)性、hoechst陽(yáng)性的進(jìn)行記數(shù)。以此說(shuō)明延遲消退后IL區(qū)神經(jīng)元的pCREB表達(dá)水平。 結(jié)果:①EXT組消退后1天僵立時(shí)間百分比(48.72±10.27)顯著低于Sham A(79.65±6.88)、Sham B(77.53±6.03)和Cont組(61.12±10.22)(P0.001),而明顯高于Naive組(55.77±10.40)(P0.01)。EXT組消退后1天(823.70±67.31)IL區(qū)pCREB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著高于Sham A(442.20±53.19),Sham B(453.20±49.47)和Cont組(564.20±55.37) (P0.001),而低于Naive組(994.00±56.62)pCREB表達(dá)(P0.01)。Sham A組和Sham B組的僵立時(shí)間百分比和IL區(qū)pCREB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)與Cont組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 ②免疫熒光三重標(biāo)記IL區(qū)pCREB陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)數(shù):在延遲消退后1天(45±5.70)、3天(62±8.39)、7天(66.2±7.59)大鼠IL區(qū)pCREB陽(yáng)性表達(dá)數(shù)呈逐漸增加趨勢(shì),其中在消退后第1、3天增加迅速(P0.001),消退后3、7天的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),消退后第7天基本回復(fù)到正常水平。條件性恐懼組IL區(qū)pCREB陽(yáng)性表達(dá)數(shù)(28±2.73)顯著低于Naive組(73.2±5.31)和延遲消退組在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)數(shù)(P0.001)。③Western Blot結(jié)果:將β-actin表達(dá)強(qiáng)度作為內(nèi)參,各組大鼠IL區(qū)pCREB目標(biāo)蛋白表達(dá)變化如下:延遲消退組在消退后1天(0.86±0.06)、3天(1.11±0.06)、7天(1.22±0.04)的pCREB蛋白表達(dá)量持續(xù)增加(P0.01),消退后1、3天增加尤為突出。條件性恐懼組大鼠pCREB蛋白表達(dá)顯著減少到(0.54±0.03)(P0.001)。消退后7天的目標(biāo)蛋白表達(dá)與Naive組(1.39±0.05)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:聲音提示的條件性恐懼伴隨IL區(qū)內(nèi)pCREB表達(dá)水平降低,而僵立行為的改善伴隨IL區(qū)pCREB表達(dá)水平的逐漸增強(qiáng)。延遲消退后第1-3天IL區(qū)內(nèi)pCREB的表達(dá)水平顯著升高,且這些表達(dá)變化主要集中在IL區(qū)神經(jīng)元內(nèi)。提示pCREB可能參與條件恐懼的消退。 實(shí)驗(yàn)三NMDA受體在大鼠條件性恐懼消退保持中的作用機(jī)制研究 目的:觀察非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑MK-801對(duì)條件性恐懼大鼠消退保持及IL區(qū)pCREB表達(dá)的影響,探討NMDA受體影響消退保持的可能機(jī)制。 方法:采用延遲消退訓(xùn)練方法,將雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為4組。訓(xùn)練前腹腔注射MK-801(Pre-MK-801)組:延遲消退訓(xùn)練前40min腹腔注射MK-801(0.3 mg/kg);訓(xùn)練后腹腔注射MK-801(Post-MK-801)組:延遲消退訓(xùn)練后4h腹腔注射MK-801(0.3 mg/kg);延遲消退組(EXT):條件性恐懼建立24h后進(jìn)行消退訓(xùn)練,給予等量生理鹽水;對(duì)照組(自然消退,Cont):只建立條件性恐懼,不進(jìn)行消退訓(xùn)練,給予等量生理鹽水。一半大鼠于消退當(dāng)日(EXT-0 d)、消退后1、3、7(EXT-1、3、7d)測(cè)定僵立時(shí)間,進(jìn)行條件性恐懼消退保持研究;另一半大鼠在上述時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn),以評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)處理后大鼠在消退期間焦慮水平的變化。同樣處理的大鼠在相同的時(shí)間點(diǎn)被處死,用于免疫熒光、Western Blot研究(3-4只大鼠/時(shí)間點(diǎn))。免疫熒光三重標(biāo)記分別指:pCREB顯示細(xì)胞核(綠),Neu-N顯示神經(jīng)元胞體和胞核(紅),hoechst染色細(xì)胞核(藍(lán))。pCREB陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)為Neu-N陽(yáng)性、hoechst陽(yáng)性的進(jìn)行記數(shù)。以此說(shuō)明延遲消退后IL區(qū)pCREB神經(jīng)元表達(dá)的水平。 結(jié)果:①各組大鼠僵立行為基礎(chǔ)值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Post-MK-801組大鼠在EXT-1、3、7天的僵立行為高于EXT組的相同時(shí)間點(diǎn)(P0.01),但明顯低于Pre-MK-801組和對(duì)照組(P0.05)。Pre-MK-801組在EXT-1、3、7天的僵立行為與對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。Cont組在EXT-7d的僵立行為低于EXT-0d(P0.05)。在消退后各時(shí)間點(diǎn)上Pre-MK-801組和Post-MK-801組的僵立行為改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 ②各組大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)百分?jǐn)?shù)(OA entries%)和開(kāi)放臂停留時(shí)間百分?jǐn)?shù)(OA time% )基礎(chǔ)值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在消退后不同時(shí)間點(diǎn),OA entries%和OA time%兩個(gè)指標(biāo)的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各組大鼠焦慮水平隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)延長(zhǎng)有所改善,但各組之間在同一時(shí)間點(diǎn)上的焦慮水平的改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 ③免疫熒光三重標(biāo)記IL區(qū)pCREB的神經(jīng)元數(shù)表達(dá): Post-MK-801組(42.80±4.32)IL區(qū)pCREB陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)低于EXT組(48.80±2.39)(P0.05),但明顯高于Pre-MK-801組(34.80±3.11)和對(duì)照組(35.60±4.16)(P0.01)。Pre-MK-801組IL區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 ④Western Blot結(jié)果顯示:將β-actin表達(dá)強(qiáng)度作為內(nèi)參,不同給藥方式大鼠IL區(qū)pCREB目標(biāo)蛋白表達(dá)變化如下:Post-MK-801組(0.71±0.06)IL區(qū)pCREB陽(yáng)性帶明顯低于EXT組(0.87±0.08)(P0.01),但明顯高于Pre-MK-801組(0.49±0.05)和對(duì)照組(0.52±0.03)(P0.01)。Pre-MK-801組IL區(qū)pCREB陽(yáng)性帶與對(duì)照組比較其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義性(P0.05)。 結(jié)論:在消退訓(xùn)練前40min、消退訓(xùn)練后4h腹腔注射MK-801不影響大鼠的焦慮行為,而影響其條件恐懼消退的鞏固和保持。消退訓(xùn)練前40min腹腔注射MK-801的消退效果明顯差于消退訓(xùn)練后4h給藥,這些行為學(xué)改變伴隨IL區(qū)pCREB神經(jīng)元表達(dá)水平的相應(yīng)改變。大鼠IL區(qū)的pCREB可能參與了條件性恐懼記憶的建立和消退過(guò)程,MK-801可能通過(guò)拮抗NMDA受體從而減弱大鼠條件性恐懼記憶的消退保持過(guò)程。這些改變主要局限于該區(qū)的神經(jīng)元,提示MK-801通過(guò)拮抗NMDA受體活性,進(jìn)而減弱條件性恐懼記憶消退保持過(guò)程。
【圖文】：

2．聲音提示的條件性恐懼記憶的腦神經(jīng)回路根據(jù)LeDoux等對(duì)嚙齒動(dòng)物和其他小型哺乳動(dòng)物的聲音條件性恐懼的研究，歸結(jié)出聽(tīng)覺(jué)條件性恐懼的加工通路如下（如圖1）：聲音條件刺激通過(guò)皮層下丘腦聽(tīng)覺(jué)加工區(qū)(丘腦內(nèi)側(cè)膝狀體)和皮層聽(tīng)覺(jué)區(qū)域(聽(tīng)覺(jué)聯(lián)合皮層) 兩條通路中的任何一條，把聽(tīng)覺(jué)刺激傳導(dǎo)到杏仁體的外側(cè)核（lat amygdaloid nucleus，，LA）[ 16,17 ]，再?gòu)腖A投射到杏仁核的中央核（central amygdaloid nucleus，CE），這是一條杏仁體內(nèi)傳遞的直接通路。與此相似，當(dāng)大鼠形成了對(duì)聲音條件刺激的恐懼性反應(yīng)時(shí)，再次回到聲音

期的第3、5、9、22天）進(jìn)行。而EPM 焦慮水平測(cè)定是對(duì)另一半大鼠在消退訓(xùn)練當(dāng)日（EXT-0d）、消退訓(xùn)練后第1、3、7、20天（實(shí)驗(yàn)日期的第3、5、9、22天）進(jìn)行焦慮水平測(cè)試前進(jìn)行。如圖1-1所示：圖 1-1 實(shí)驗(yàn)程序2.5 EPM 實(shí)驗(yàn)條件及測(cè)試指標(biāo)（1）實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光線亮度為大鼠習(xí)慣的生活亮度（以1.5 m 距離處能區(qū)分大鼠細(xì)微活動(dòng)的最低亮度為準(zhǔn)）并保持恒亮，室溫 25℃ 左右，房間隔音。將大鼠放于EPM的中央平臺(tái)上，鼠頭統(tǒng)一朝向一個(gè)開(kāi)放臂，30秒適應(yīng)后，開(kāi)始記錄其 10min 內(nèi)的行為。記錄大鼠在進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)和在開(kāi)放臂停留時(shí)間。每只實(shí)驗(yàn)大鼠實(shí)驗(yàn)完成后清除其排泄物以排除對(duì)其他大鼠的影響。-34-（2）測(cè)試指標(biāo)：進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)（open arm entries，OA）：進(jìn)入到任一開(kāi)放臂的次數(shù)，以大鼠 4 個(gè)爪子均進(jìn)入到臂內(nèi)為準(zhǔn)，中途 1 個(gè)爪子從該臂中完全退出則為該次進(jìn)入活動(dòng)完成。進(jìn)入開(kāi)放臂時(shí)間（open arm time
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R749.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃輝,阮懷珍,范曉棠,張金海;低壓低氧對(duì)胎鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;2002年04期

本文編號(hào)：2690419