【摘要】： 隨著突發(fā)性災(zāi)難事件的增多,創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)成為全球關(guān)注的熱點。PTSD的本質(zhì)是一系列與創(chuàng)傷事件相關(guān)的記憶(條件性恐懼),創(chuàng)傷性記憶一旦形成,很難自然消失,嚴重影響日常生活。暴露療法的原理是創(chuàng)傷記憶的消退,但其對PTSD的療效難以維持,表現(xiàn)為已消退的恐懼記憶又很快再現(xiàn)。提示消退保持(extinction retention)障礙可能是創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)生和治療困難的關(guān)鍵。既往實驗表明內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medial prefrontal cortex,mPFC)邊緣下區(qū)(infralimbic area,IL)與PTSD發(fā)生、發(fā)展和治療結(jié)局密切相關(guān),然而,其在條件性恐懼消退保持中的作用和機制尚不清楚。 我們在以往學(xué)者研究的基礎(chǔ)上,綜合行為藥理學(xué)、形態(tài)學(xué)以及Western Blot方法探索條件性恐懼記憶消退的最佳“時間窗”,探討IL區(qū)在條件性恐懼記憶消退保持中的作用及其機制,為提高并鞏固PTSD治療效果提供實驗依據(jù)。為達成這一目的,設(shè)計了以下3個實驗。 實驗一不同消退方式后條件性恐懼大鼠消退保持的動態(tài)觀察 目的:探討條件性恐懼大鼠經(jīng)歷不同消退訓(xùn)練后,消退記憶保持水平的動態(tài)變化。 方法:條件刺激(聲音)與非條件刺激(不可逃避的足底電擊)配對呈現(xiàn)建立條件性恐懼;隨后重復(fù)呈現(xiàn)單獨的條件刺激用于消退訓(xùn)練。48只SD雄性大鼠隨機分為3組:對照組(自然消退,Cont組),大鼠建立聲音提示的條件性恐懼而不進行消退訓(xùn)練;立即消退組(Imme EXT),建立條件性恐懼后15min進行消退訓(xùn)練;延遲消退組(EXT組),建立條件性恐懼后24h進行消退訓(xùn)練。以上三組大鼠一半于建模后第1、3、7、20天測試僵立行為(大鼠連續(xù)10min內(nèi)僵立時間百分比);另一半分別于消退后第1、3、7、20天通過高架十字迷宮測試焦慮行為。 結(jié)果:①Cont,Imme EXT和EXT組僵立行為基礎(chǔ)值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。EXT組的消退效果好于Imme EXT和Cont組(P0.001),其遠期消退效果持續(xù)穩(wěn)定;EXT組大鼠消退后第1、3天的僵立行為顯著下降(P0.01),第7天已接近正常水平。Imme EXT組和Cont組間消退效果的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05)。各組大鼠在消退后7-20天僵立行為的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 ②Cont,Imme EXT和EXT組的開放臂進入次數(shù)百分比(OA time%)和開放臂停留時間百分比(OA time%)基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05);在消退后不同時間點,OA entries%和OA time%兩個指標的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)�？傮w來說,各組動物隨實驗天數(shù)延長其焦慮水平逐漸降低,但各組之間在同一時間點上的焦慮水平的改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05)。 結(jié)論:不同的消退訓(xùn)練方式對條件性恐懼大鼠的遠期消退效果不同,延遲消退訓(xùn)練方式效果最好。同時,由于不同處理組大鼠的焦慮水平類似,排除了立即消退組僵立評分值較高是焦慮水平升高所致。 實驗二條件性恐懼消退保持過程中IL區(qū)磷酸化CREB的動態(tài)變化 目的:探討條件性恐懼大鼠經(jīng)歷不同消退訓(xùn)練后,消退記憶保持過程中,IL區(qū)pCREB的變化。 方法:實驗一觀察到條件性恐懼延遲消退訓(xùn)練效果好于立即消退訓(xùn)練,且消退后1-3天的消退效果最為明顯。本實驗采用聲音-足底電擊配對(條件恐懼)或非配對(非條件恐懼)刺激后,使用延遲消退方式訓(xùn)練大鼠,比較非條件恐懼和條件恐懼延遲消退后大鼠僵立行為變化和IL區(qū)pCREB的表達不同,同時觀察條件恐懼延遲消退組在消退后1、3、7天IL區(qū)信號分子pCREB的動態(tài)變化。將SD雄性成年大鼠隨機分為5組:空白組(Naive組,無任何處理),假訓(xùn)練A組(Sham A,聲音和足底電刺激不配對呈現(xiàn)),假訓(xùn)練B組(Sham B,僅有足底電刺激),條件性恐懼組(Cont組,無消退訓(xùn)練),延遲消退組(EXT組)。除Cont組外,其余各組均采用與實驗一相同的延遲消退訓(xùn)練方式,在消退后24h取材; EXT組在延遲消退后不同時間點(消退后1、3、7天)取材;各組均采用免疫熒光染色及Western Blot定位和半定量檢測目標蛋白pCREB的表達水平(3-4只大鼠/時間點)。免疫熒光單一標記各組IL區(qū)pCREB以說明非條件恐懼對IL區(qū)細胞pCREB表達的影響。免疫熒光三重標記分別指:pCREB顯示細胞核(綠),Neu-N顯示神經(jīng)元胞體和胞核(紅),hoechst染色細胞核(藍)。pCREB陽性細胞同時為Neu-N陽性、hoechst陽性的進行記數(shù)。以此說明延遲消退后IL區(qū)神經(jīng)元的pCREB表達水平。 結(jié)果:①EXT組消退后1天僵立時間百分比(48.72±10.27)顯著低于Sham A(79.65±6.88)、Sham B(77.53±6.03)和Cont組(61.12±10.22)(P0.001),而明顯高于Naive組(55.77±10.40)(P0.01)。EXT組消退后1天(823.70±67.31)IL區(qū)pCREB陽性細胞表達顯著高于Sham A(442.20±53.19),Sham B(453.20±49.47)和Cont組(564.20±55.37) (P0.001),而低于Naive組(994.00±56.62)pCREB表達(P0.01)。Sham A組和Sham B組的僵立時間百分比和IL區(qū)pCREB陽性細胞表達與Cont組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 ②免疫熒光三重標記IL區(qū)pCREB陽性神經(jīng)元表達數(shù):在延遲消退后1天(45±5.70)、3天(62±8.39)、7天(66.2±7.59)大鼠IL區(qū)pCREB陽性表達數(shù)呈逐漸增加趨勢,其中在消退后第1、3天增加迅速(P0.001),消退后3、7天的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),消退后第7天基本回復(fù)到正常水平。條件性恐懼組IL區(qū)pCREB陽性表達數(shù)(28±2.73)顯著低于Naive組(73.2±5.31)和延遲消退組在各時間點的表達數(shù)(P0.001)。③Western Blot結(jié)果:將β-actin表達強度作為內(nèi)參,各組大鼠IL區(qū)pCREB目標蛋白表達變化如下:延遲消退組在消退后1天(0.86±0.06)、3天(1.11±0.06)、7天(1.22±0.04)的pCREB蛋白表達量持續(xù)增加(P0.01),消退后1、3天增加尤為突出。條件性恐懼組大鼠pCREB蛋白表達顯著減少到(0.54±0.03)(P0.001)。消退后7天的目標蛋白表達與Naive組(1.39±0.05)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:聲音提示的條件性恐懼伴隨IL區(qū)內(nèi)pCREB表達水平降低,而僵立行為的改善伴隨IL區(qū)pCREB表達水平的逐漸增強。延遲消退后第1-3天IL區(qū)內(nèi)pCREB的表達水平顯著升高,且這些表達變化主要集中在IL區(qū)神經(jīng)元內(nèi)。提示pCREB可能參與條件恐懼的消退。 實驗三NMDA受體在大鼠條件性恐懼消退保持中的作用機制研究 目的:觀察非競爭性NMDA受體拮抗劑MK-801對條件性恐懼大鼠消退保持及IL區(qū)pCREB表達的影響,探討NMDA受體影響消退保持的可能機制。 方法:采用延遲消退訓(xùn)練方法,將雄性成年SD大鼠隨機分為4組。訓(xùn)練前腹腔注射MK-801(Pre-MK-801)組:延遲消退訓(xùn)練前40min腹腔注射MK-801(0.3 mg/kg);訓(xùn)練后腹腔注射MK-801(Post-MK-801)組:延遲消退訓(xùn)練后4h腹腔注射MK-801(0.3 mg/kg);延遲消退組(EXT):條件性恐懼建立24h后進行消退訓(xùn)練,給予等量生理鹽水;對照組(自然消退,Cont):只建立條件性恐懼,不進行消退訓(xùn)練,給予等量生理鹽水。一半大鼠于消退當(dāng)日(EXT-0 d)、消退后1、3、7(EXT-1、3、7d)測定僵立時間,進行條件性恐懼消退保持研究;另一半大鼠在上述時間點進行高架十字迷宮實驗,以評價實驗處理后大鼠在消退期間焦慮水平的變化。同樣處理的大鼠在相同的時間點被處死,用于免疫熒光、Western Blot研究(3-4只大鼠/時間點)。免疫熒光三重標記分別指:pCREB顯示細胞核(綠),Neu-N顯示神經(jīng)元胞體和胞核(紅),hoechst染色細胞核(藍)。pCREB陽性細胞同時為Neu-N陽性、hoechst陽性的進行記數(shù)。以此說明延遲消退后IL區(qū)pCREB神經(jīng)元表達的水平。 結(jié)果:①各組大鼠僵立行為基礎(chǔ)值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Post-MK-801組大鼠在EXT-1、3、7天的僵立行為高于EXT組的相同時間點(P0.01),但明顯低于Pre-MK-801組和對照組(P0.05)。Pre-MK-801組在EXT-1、3、7天的僵立行為與對照組相同時間點比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.05)。Cont組在EXT-7d的僵立行為低于EXT-0d(P0.05)。在消退后各時間點上Pre-MK-801組和Post-MK-801組的僵立行為改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 ②各組大鼠進入開放臂次數(shù)百分數(shù)(OA entries%)和開放臂停留時間百分數(shù)(OA time% )基礎(chǔ)值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在消退后不同時間點,OA entries%和OA time%兩個指標的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組大鼠焦慮水平隨實驗天數(shù)延長有所改善,但各組之間在同一時間點上的焦慮水平的改變無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 ③免疫熒光三重標記IL區(qū)pCREB的神經(jīng)元數(shù)表達: Post-MK-801組(42.80±4.32)IL區(qū)pCREB陽性神經(jīng)元數(shù)低于EXT組(48.80±2.39)(P0.05),但明顯高于Pre-MK-801組(34.80±3.11)和對照組(35.60±4.16)(P0.01)。Pre-MK-801組IL區(qū)陽性細胞數(shù)與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 ④Western Blot結(jié)果顯示:將β-actin表達強度作為內(nèi)參,不同給藥方式大鼠IL區(qū)pCREB目標蛋白表達變化如下:Post-MK-801組(0.71±0.06)IL區(qū)pCREB陽性帶明顯低于EXT組(0.87±0.08)(P0.01),但明顯高于Pre-MK-801組(0.49±0.05)和對照組(0.52±0.03)(P0.01)。Pre-MK-801組IL區(qū)pCREB陽性帶與對照組比較其差異無統(tǒng)計學(xué)意義性(P0.05)。 結(jié)論:在消退訓(xùn)練前40min、消退訓(xùn)練后4h腹腔注射MK-801不影響大鼠的焦慮行為,而影響其條件恐懼消退的鞏固和保持。消退訓(xùn)練前40min腹腔注射MK-801的消退效果明顯差于消退訓(xùn)練后4h給藥,這些行為學(xué)改變伴隨IL區(qū)pCREB神經(jīng)元表達水平的相應(yīng)改變。大鼠IL區(qū)的pCREB可能參與了條件性恐懼記憶的建立和消退過程,MK-801可能通過拮抗NMDA受體從而減弱大鼠條件性恐懼記憶的消退保持過程。這些改變主要局限于該區(qū)的神經(jīng)元,提示MK-801通過拮抗NMDA受體活性,進而減弱條件性恐懼記憶消退保持過程。
【圖文】：

2．聲音提示的條件性恐懼記憶的腦神經(jīng)回路根據(jù)LeDoux等對嚙齒動物和其他小型哺乳動物的聲音條件性恐懼的研究，歸結(jié)出聽覺條件性恐懼的加工通路如下（如圖1）：聲音條件刺激通過皮層下丘腦聽覺加工區(qū)(丘腦內(nèi)側(cè)膝狀體)和皮層聽覺區(qū)域(聽覺聯(lián)合皮層) 兩條通路中的任何一條，把聽覺刺激傳導(dǎo)到杏仁體的外側(cè)核（lat amygdaloid nucleus，，LA）[ 16,17 ]，再從LA投射到杏仁核的中央核（central amygdaloid nucleus，CE），這是一條杏仁體內(nèi)傳遞的直接通路。與此相似，當(dāng)大鼠形成了對聲音條件刺激的恐懼性反應(yīng)時，再次回到聲音

期的第3、5、9、22天）進行。而EPM 焦慮水平測定是對另一半大鼠在消退訓(xùn)練當(dāng)日（EXT-0d）、消退訓(xùn)練后第1、3、7、20天（實驗日期的第3、5、9、22天）進行焦慮水平測試前進行。如圖1-1所示：圖 1-1 實驗程序2.5 EPM 實驗條件及測試指標（1）實驗條件：實驗室內(nèi)光線亮度為大鼠習(xí)慣的生活亮度（以1.5 m 距離處能區(qū)分大鼠細微活動的最低亮度為準）并保持恒亮，室溫 25℃ 左右，房間隔音。將大鼠放于EPM的中央平臺上，鼠頭統(tǒng)一朝向一個開放臂，30秒適應(yīng)后，開始記錄其 10min 內(nèi)的行為。記錄大鼠在進入開放臂次數(shù)和在開放臂停留時間。每只實驗大鼠實驗完成后清除其排泄物以排除對其他大鼠的影響。-34-（2）測試指標：進入開放臂次數(shù)（open arm entries，OA）：進入到任一開放臂的次數(shù)，以大鼠 4 個爪子均進入到臂內(nèi)為準，中途 1 個爪子從該臂中完全退出則為該次進入活動完成。進入開放臂時間（open arm time
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R749.5

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃輝,阮懷珍,范曉棠,張金海;低壓低氧對胎鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體影響的實驗研究[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2002年04期

本文編號：2690419