【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種起病隱匿的漸進性和不可逆的腦部疾病,病因復(fù)雜,疾病機制尚不明確。因為缺乏臨床早期診斷的指標(biāo)使其早期的干預(yù)治療存在眾多困難。目前多項治療AD的新藥研發(fā)以失敗告終,膽堿酯酶抑制劑中的經(jīng)典藥物多奈哌齊(Donepezil,DNP)目前仍然是AD治療的一線用藥。但該藥物臨床應(yīng)用中存在個體差異大及具有膽堿酯酶抑制之外的機制尚不明確的臨床作用等特點。我們的研究目的是通過臨床和基礎(chǔ)研究,尋找AD疾病診斷及膽堿酯酶抑制劑療效評價的生物標(biāo)志物,同時揭示疾病及藥物作用的潛在機制。目前AD的相關(guān)研究集中在該病的病理性靶器官腦組織但是尚無突破性發(fā)現(xiàn)。本研究采用中西醫(yī)結(jié)合方式,依照“心主神志”的傳統(tǒng)中醫(yī)理論,從“心主神志”理論的物質(zhì)基礎(chǔ)血為出發(fā)點,結(jié)合AD治療中的“從心論治”臨床實踐,確定了與心腦密切相關(guān)的脂質(zhì)代謝,包括能量物質(zhì)及調(diào)節(jié)能量代謝的脂肪因子來研究AD疾病診斷及藥物治療機制。在利用“心主神志”中醫(yī)理論確定研究方向的基礎(chǔ)上,我們采用現(xiàn)代GC-MS分析技術(shù),對臨床樣本進行了目標(biāo)成分為脂質(zhì)的非靶向代謝物組學(xué)研究。臨床樣本分為非AD老年受試者組、AD初次診斷未服用DNP組、DNP有效組及DNP無效組。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AD中存在脂質(zhì)代謝紊亂,DNP與脂質(zhì)代謝存在關(guān)聯(lián)性。心腦重要能量物質(zhì)酮體在AD疾病進展及DNP療效中為差異性物質(zhì)。為了進一步明確酮體在AD疾病及DNP療效中的地位,在非靶向代謝物組學(xué)研究基礎(chǔ)上我們建立了液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)靶向代謝物組學(xué)研究方法,對酮體主要成分3-羥基丁酸進行了精確定量分析。研究結(jié)果表明3-羥基丁酸的血漿濃度水平在AD中顯著低于非AD對照組,具備AD疾病診斷的生物標(biāo)志物特征。DNP與3-羥基丁酸血漿濃度水平具有相關(guān)性,DNP有效組3-羥基丁酸濃度高于AD未服藥組,提示DNP可能促進生酮。中醫(yī)理論“心主神志”提示心腦的密切關(guān)聯(lián)性。調(diào)節(jié)能量代謝的脂肪因子脂聯(lián)素在心腦疾病中都占有重要地位。本研究中利用酶聯(lián)免疫分析方法測定了臨床樣本中脂聯(lián)素的濃度水平,利用多重PCR-LDR基因多態(tài)性檢測方法進行了脂聯(lián)素單核苷酸基因多態(tài)性研究,并將研究結(jié)果與代謝物組學(xué)研究結(jié)果相聯(lián)系,評價脂聯(lián)素與AD疾病進展及DNP療效的相關(guān)性。研究結(jié)果表明AD中脂聯(lián)素水平呈現(xiàn)上升趨勢,但相關(guān)的生物學(xué)功能沒有增加,推測AD中存在脂聯(lián)素抵抗。DNP藥物療效與脂聯(lián)素濃度水平具有關(guān)聯(lián)性,提示DNP可能影響脂聯(lián)素的釋放。脂聯(lián)素具備評價DNP療效的生物標(biāo)志物的特征。脂聯(lián)素的單核苷酸基因多態(tài)性在AD患者中與脂聯(lián)素濃度水平及DNP的療效沒有顯著的關(guān)聯(lián)性,提示關(guān)注脂聯(lián)素釋放部位的重要性。針對DNP與酮體及脂聯(lián)素密切相關(guān)的臨床研究發(fā)現(xiàn),提示DNP可能促進生酮或者影響脂聯(lián)素釋放。為了排除疾病因素對結(jié)果的影響,我們采用禁食及多劑量給藥的健康動物模型,通過評價體循環(huán)及重要器官組織中酮體或者脂聯(lián)素的水平以及肝臟或者脂肪組織中重要的生酮限速酶或者脂聯(lián)素及其受體相關(guān)基因和蛋白的表達,明確DNP對酮體生成和脂聯(lián)素釋放的影響。研究結(jié)果表明DNP在動物體內(nèi)能夠促進生酮,也能夠促進脂聯(lián)素的釋放。以上研究結(jié)果結(jié)合臨床發(fā)現(xiàn),可以為DNP臨床應(yīng)用中的一些非膽堿酯酶抑制作用的發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。依照“心主神志”中醫(yī)理論,因為酮體的利用與心臟功能密切相關(guān),本研究的最后一部分重點關(guān)注了DNP對心臟酮體的利用的影響。采用多劑量給藥動物及高糖造模的H9C2細(xì)胞模型,研究DNP對酮體利用過程中的關(guān)鍵基因及蛋白的表達調(diào)控作用。結(jié)果表明,DNP能夠上調(diào)酮體利用中的關(guān)鍵酶的表達,提示DNP能夠促進酮體利用。結(jié)合文獻報道的DNP在AD治療中對心血管有益的臨床發(fā)現(xiàn),我們推測DNP在AD治療也具有增加心臟能量代謝的功能。這也是對傳統(tǒng)的“心主神志”中醫(yī)理論的科學(xué)性的一個有力證明。本研究從“心主神志”中醫(yī)理論出發(fā),研究了AD疾病進展及DNP作用機制與小分子能量物質(zhì)及脂肪因子的關(guān)聯(lián)性,發(fā)現(xiàn)了小分子能量物質(zhì)及與能量代謝密切相關(guān)的脂肪因子在AD疾病診斷及DNP療效中評價中占有重要地位。同時發(fā)現(xiàn)了DNP對心臟酮體利用的促進作用。本研究依照傳統(tǒng)中醫(yī)理論制定了研究方向,研究結(jié)果也證實了傳統(tǒng)中醫(yī)理論的科學(xué)性。
【圖文】：

- 34 -圖 3-1 四組樣本的主成分分析(PCA)得分圖(Scores plot)Figrue3-1. Score plots of statistical models for GC-MS analysis of human plasma. PCAfor fourgroups (samples are color-coded according to the different groups)2）偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）采用 PLS-DA 這種監(jiān)督的多維統(tǒng)計分析方法對這四組樣本進行模型分析。該種分析主要是過濾掉組內(nèi)噪音干擾，從而凸顯組間的差異。本模型共獲得 3 個主成分，R2X=0.139，R2Y=0.541，Q2=0.278，得分圖如圖 3-2 示（橫坐標(biāo)為第 1 主成分的得分值，用 t[1]表示；縱坐標(biāo)為第 2 主成分的得分值，用 t[2]表示）。模型解釋率 R2Y 比較高，說明 PLS-DA 模型可用于解釋四組樣本之間的差異。健康對照組分布于得分圖 2-2 的最右側(cè)，而 AD 組則分布于上部偏右上區(qū)域，藥物治療有效組則主要分布于左下區(qū)域（遠(yuǎn)離 AD 組）并在空間上較藥物無效組更接近于健康對照組。圖 2-2 表明，4 組樣本之間具有較明顯的代謝譜差異。

- 35 -圖 3-2 四組樣本的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)得分圖(Scores plot)Figrue3-2. Score plots of statistical models for GC-MS analysis of human plasma. PLS-DAfor fourgroups (samples are color-coded according to the different groups)3.2.3AD 組與健康對照組對比分析1）主成分分析（PCA）共獲得 8 個主成分，，模型累積解釋率 R2X=0.500，Q2=0.103。當(dāng)前 PCA 模型能可靠地用于解釋兩組樣本之間的代謝差異。非 AD 對照組與 AD 組在 PCA 得分圖的 PC1 和 PC2 上無明顯分離（圖 3-3 左上圖），說明兩組樣本在 PCA 模型上無差異。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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本文編號：2687114