【摘要】：20世紀(jì)以來(lái),人們對(duì)生命的期望急劇上升,在人均壽命逐漸升高的情況下,由阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)引起的老年癡呆約占癡呆老人總數(shù)的80%,影響全世界6%的老年人口。病理學(xué)已經(jīng)解釋AD的標(biāo)志蛋白之一為Tau蛋白,而目前Tau蛋白的常規(guī)檢測(cè)方法為ELISA與Western Blot,這兩種方法具有檢測(cè)精度低、檢測(cè)用時(shí)長(zhǎng)、儀器昂貴等缺點(diǎn)。近年來(lái),隨著電化學(xué)傳感器的發(fā)展,關(guān)于蛋白質(zhì)的電化學(xué)研究已漸漸深入。其中,電化學(xué)阻抗譜(electrochemical impedance spectrum,EIS)是分析系統(tǒng)復(fù)雜電阻的有效方法,該方法對(duì)表面現(xiàn)象和整體性質(zhì)的變化敏感,且檢測(cè)不影響蛋白構(gòu)象,非常適合對(duì)微量蛋白質(zhì)的檢測(cè)。本文首先對(duì)阿爾茨海默癥及其標(biāo)志蛋白Tau做簡(jiǎn)要介紹,在總結(jié)分析常規(guī)檢測(cè)Tau蛋白方法優(yōu)缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上,提出使用電化學(xué)阻抗法對(duì)Tau蛋白進(jìn)行表征,并通過(guò)對(duì)EIS技術(shù)原理及其目前對(duì)蛋白檢測(cè)的現(xiàn)狀進(jìn)行分析,為構(gòu)建針對(duì)Tau蛋白的自組裝傳感器打下理論基礎(chǔ)。本文基于免疫原理,采用自組裝技術(shù)制備免疫阻抗傳感器。本文試驗(yàn)研究了傳感器構(gòu)建步驟及其參數(shù)的優(yōu)化,成功制備了能夠?qū)au441蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)的自組裝免疫阻抗傳感器。該傳感器通過(guò)電化學(xué)交流阻抗法進(jìn)行表征,同時(shí)通過(guò)循環(huán)伏安法進(jìn)行驗(yàn)證。該免疫傳感器具體構(gòu)建步驟如下:首先對(duì)金電極進(jìn)行打磨,超純水沖洗后將電極浸入DTSSP溶液,室溫過(guò)夜,通過(guò)巰基-金化學(xué)鍵將DTSSP修飾到金表面。隨后在電極表面滴加抗體39E10,室溫孵育1h,通過(guò)烷磺基-氨基結(jié)合抗體,并使用乙醇胺封閉電極表面所有未反應(yīng)的活性酯基。至此,用來(lái)檢測(cè)Tau441的免疫傳感器制備完成。最后將構(gòu)建好的自組裝傳感器對(duì)Tau441蛋白進(jìn)行捕獲。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:Tau441蛋白濃度在0.02μg/mL-20μg/mL范圍內(nèi),Tau蛋白濃度與阻抗值具有線性關(guān)系,R~2=0.9888,即相關(guān)系數(shù)R=0.994,線性方程式為y=3.2702x+9.9758。人血清中含量最高的蛋白為人血清蛋白,因此,實(shí)驗(yàn)研究了該免疫傳感器結(jié)合與Tau441蛋白相同濃度的人血清蛋白,證實(shí)自制免疫阻抗傳感器對(duì)Tau441蛋白具有良好的特異性。為進(jìn)一步改善該阻抗免疫傳感器的性能,提高其靈敏度,試驗(yàn)研究引入Tau441的抗體Tau-12作為二抗,其與Tau441蛋白及39E10(一抗)形成三明治夾心復(fù)合物結(jié)構(gòu),構(gòu)建免疫夾心傳感器,對(duì)免疫傳感器的信號(hào)進(jìn)行放大。試驗(yàn)研究結(jié)果表明:自組裝夾心免疫傳感器成功對(duì)免疫傳感器捕獲的信號(hào)進(jìn)行放大。當(dāng)Tau441濃度在0.0002μg/mL-2μg/mL范圍內(nèi),其濃度對(duì)數(shù)值與其阻抗之間呈線性關(guān)系,線性方程式為y=8.7301x+33.16,R~2=0.9779,即相關(guān)系數(shù)為0.9888。論文亦試驗(yàn)研究了該傳感器在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用的可行性。試驗(yàn)配制人工腦脊液,通過(guò)模擬人腦脊液環(huán)境,用該免疫阻抗傳感器對(duì)Tau441蛋白進(jìn)行捕獲。結(jié)果顯示Tau441蛋白濃度在0.0002μg/mL-2μg/mL范圍內(nèi),其濃度對(duì)數(shù)值與其對(duì)應(yīng)阻抗具有線性關(guān)系,線性方程式為y=1.4471lnx+13.396,相關(guān)系數(shù)為0.9831。論文構(gòu)建的自組裝傳感器對(duì)Tau蛋白的檢測(cè)均在10分鐘內(nèi)結(jié)束。綜上,論文構(gòu)建了能夠?qū)Π柎暮Ｄ瑯?biāo)志蛋白(Tau)進(jìn)行快速檢測(cè)的免疫夾心阻抗生物傳感器,并試驗(yàn)研究了該免疫傳感器在人工腦脊液樣本中的應(yīng)用。研究結(jié)果表明:本文構(gòu)建的夾心免疫阻抗傳感器對(duì)微量Tau蛋白的捕獲具有特異性好、重復(fù)率高、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。本研究為臨床上檢測(cè)早期AD患者腦脊液中的Tau蛋白提供了一種可供選擇的方法,對(duì)AD疾病早期診斷具有重大的意義。
【圖文】：

圖 1.1 阿爾茨海默病理特征圖[9]樣蛋白假說(shuō)幾年，淀粉樣蛋白假說(shuō)是 AD 發(fā)病原因的主流假說(shuō)。由于淀粉樣多肽（β-A系統(tǒng)中發(fā)生聚集或者自組裝成纖維狀，導(dǎo)致異常沉淀，產(chǎn)生具有β-折疊的聚集物由于不能被清除而在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)聚集成斑點(diǎn)樣斑塊。Aβ聚集物與突激發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥，引發(fā)神經(jīng)信號(hào)傳遞紊亂甚至直接損傷神經(jīng)元[11白假說(shuō)，由于針對(duì)淀粉樣蛋白的藥物臨床實(shí)驗(yàn)失敗，以及在 Tau 蛋白研究取得的研究者將目光從 Aβ蛋白轉(zhuǎn)移到 Tau 蛋白[14, 15]。Tau 蛋白是一種具有親水性微管相關(guān)蛋白(microtuble associated protein，MAP)，能保持神經(jīng)元生長(zhǎng)，并細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。Tau 蛋白的 cDNA 最初從小鼠大腦腦脊液中分離出來(lái)爾茨海默病小鼠的腦脊液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其腦中 Tau 蛋白發(fā)生過(guò)度磷酸化管蛋白，從而影響正常的生理活動(dòng)[16]。Tau 蛋白穩(wěn)定的存在于神經(jīng)元細(xì)胞白從微管上解離并形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)和成對(duì)螺旋絲（paired helical fila

杭州電子科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，參與許多生理功能如保持細(xì)胞形狀、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞分裂等。其中理學(xué)功能是參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成，，正常的 Tau 蛋白作為微管核心部分與微成微管，并維持微管的穩(wěn)定[29]，另外，Tau 蛋白對(duì)維持神經(jīng)細(xì)胞正常形態(tài) Tau 蛋白與細(xì)胞骨架蛋白具有相互作用，能夠提高 DNA 的復(fù)性能力，避的損害[30]。如圖 1.2 所示，Tau 蛋白在正常人腦組織中存在一定程度的磷酸和蘇氨酸的磷酸化。其中 AD 患者腦脊液中的過(guò)磷酸化的 Tau 蛋白含量，這種過(guò)磷酸化會(huì)導(dǎo)致蛋白脫離微管導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)，脫離過(guò)程會(huì)產(chǎn)正常生理功能的喪失[31]。前文介紹 AD 病變最常見的癥狀是神經(jīng)性病變，白的過(guò)磷酸化導(dǎo)致錯(cuò)誤聚集并形成不溶性的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的纏結(jié)。
【學(xué)位授予單位】：杭州電子科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.16;TP212.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2682988