【摘要】：20世紀以來,人們對生命的期望急劇上升,在人均壽命逐漸升高的情況下,由阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)引起的老年癡呆約占癡呆老人總數的80%,影響全世界6%的老年人口。病理學已經解釋AD的標志蛋白之一為Tau蛋白,而目前Tau蛋白的常規(guī)檢測方法為ELISA與Western Blot,這兩種方法具有檢測精度低、檢測用時長、儀器昂貴等缺點。近年來,隨著電化學傳感器的發(fā)展,關于蛋白質的電化學研究已漸漸深入。其中,電化學阻抗譜(electrochemical impedance spectrum,EIS)是分析系統復雜電阻的有效方法,該方法對表面現象和整體性質的變化敏感,且檢測不影響蛋白構象,非常適合對微量蛋白質的檢測。本文首先對阿爾茨海默癥及其標志蛋白Tau做簡要介紹,在總結分析常規(guī)檢測Tau蛋白方法優(yōu)缺點的基礎上,提出使用電化學阻抗法對Tau蛋白進行表征,并通過對EIS技術原理及其目前對蛋白檢測的現狀進行分析,為構建針對Tau蛋白的自組裝傳感器打下理論基礎。本文基于免疫原理,采用自組裝技術制備免疫阻抗傳感器。本文試驗研究了傳感器構建步驟及其參數的優(yōu)化,成功制備了能夠對Tau441蛋白進行特異性檢測的自組裝免疫阻抗傳感器。該傳感器通過電化學交流阻抗法進行表征,同時通過循環(huán)伏安法進行驗證。該免疫傳感器具體構建步驟如下:首先對金電極進行打磨,超純水沖洗后將電極浸入DTSSP溶液,室溫過夜,通過巰基-金化學鍵將DTSSP修飾到金表面。隨后在電極表面滴加抗體39E10,室溫孵育1h,通過烷磺基-氨基結合抗體,并使用乙醇胺封閉電極表面所有未反應的活性酯基。至此,用來檢測Tau441的免疫傳感器制備完成。最后將構建好的自組裝傳感器對Tau441蛋白進行捕獲。實驗研究結果表明:Tau441蛋白濃度在0.02μg/mL-20μg/mL范圍內,Tau蛋白濃度與阻抗值具有線性關系,R~2=0.9888,即相關系數R=0.994,線性方程式為y=3.2702x+9.9758。人血清中含量最高的蛋白為人血清蛋白,因此,實驗研究了該免疫傳感器結合與Tau441蛋白相同濃度的人血清蛋白,證實自制免疫阻抗傳感器對Tau441蛋白具有良好的特異性。為進一步改善該阻抗免疫傳感器的性能,提高其靈敏度,試驗研究引入Tau441的抗體Tau-12作為二抗,其與Tau441蛋白及39E10(一抗)形成三明治夾心復合物結構,構建免疫夾心傳感器,對免疫傳感器的信號進行放大。試驗研究結果表明:自組裝夾心免疫傳感器成功對免疫傳感器捕獲的信號進行放大。當Tau441濃度在0.0002μg/mL-2μg/mL范圍內,其濃度對數值與其阻抗之間呈線性關系,線性方程式為y=8.7301x+33.16,R~2=0.9779,即相關系數為0.9888。論文亦試驗研究了該傳感器在實際檢測中應用的可行性。試驗配制人工腦脊液,通過模擬人腦脊液環(huán)境,用該免疫阻抗傳感器對Tau441蛋白進行捕獲。結果顯示Tau441蛋白濃度在0.0002μg/mL-2μg/mL范圍內,其濃度對數值與其對應阻抗具有線性關系,線性方程式為y=1.4471lnx+13.396,相關系數為0.9831。論文構建的自組裝傳感器對Tau蛋白的檢測均在10分鐘內結束。綜上,論文構建了能夠對阿爾茨海默標志蛋白(Tau)進行快速檢測的免疫夾心阻抗生物傳感器,并試驗研究了該免疫傳感器在人工腦脊液樣本中的應用。研究結果表明:本文構建的夾心免疫阻抗傳感器對微量Tau蛋白的捕獲具有特異性好、重復率高、檢測時間短等優(yōu)點。本研究為臨床上檢測早期AD患者腦脊液中的Tau蛋白提供了一種可供選擇的方法,對AD疾病早期診斷具有重大的意義。
【圖文】：

圖 1.1 阿爾茨海默病理特征圖[9]樣蛋白假說幾年，淀粉樣蛋白假說是 AD 發(fā)病原因的主流假說。由于淀粉樣多肽（β-A系統中發(fā)生聚集或者自組裝成纖維狀，導致異常沉淀，產生具有β-折疊的聚集物由于不能被清除而在神經系統內聚集成斑點樣斑塊。Aβ聚集物與突激發(fā)膠質細胞，產生炎癥，引發(fā)神經信號傳遞紊亂甚至直接損傷神經元[11白假說，由于針對淀粉樣蛋白的藥物臨床實驗失敗，以及在 Tau 蛋白研究取得的研究者將目光從 Aβ蛋白轉移到 Tau 蛋白[14, 15]。Tau 蛋白是一種具有親水性微管相關蛋白(microtuble associated protein，MAP)，能保持神經元生長，并細胞內的物質轉運。Tau 蛋白的 cDNA 最初從小鼠大腦腦脊液中分離出來爾茨海默病小鼠的腦脊液進行檢測，發(fā)現其腦中 Tau 蛋白發(fā)生過度磷酸化管蛋白，從而影響正常的生理活動[16]。Tau 蛋白穩(wěn)定的存在于神經元細胞白從微管上解離并形成神經元纖維纏結和成對螺旋絲（paired helical fila

杭州電子科技大學碩士學位論文，參與許多生理功能如保持細胞形狀、細胞內運輸、細胞分裂等。其中理學功能是參與細胞骨架的構成，，正常的 Tau 蛋白作為微管核心部分與微成微管，并維持微管的穩(wěn)定[29]，另外，Tau 蛋白對維持神經細胞正常形態(tài) Tau 蛋白與細胞骨架蛋白具有相互作用，能夠提高 DNA 的復性能力，避的損害[30]。如圖 1.2 所示，Tau 蛋白在正常人腦組織中存在一定程度的磷酸和蘇氨酸的磷酸化。其中 AD 患者腦脊液中的過磷酸化的 Tau 蛋白含量，這種過磷酸化會導致蛋白脫離微管導致神經元纖維纏結，脫離過程會產正常生理功能的喪失[31]。前文介紹 AD 病變最常見的癥狀是神經性病變，白的過磷酸化導致錯誤聚集并形成不溶性的神經網絡中的纏結。
【學位授予單位】：杭州電子科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16;TP212.3

【參考文獻】

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本文編號：2682988