【摘要】：背景:以細(xì)胞內(nèi)tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和APP剪切而成的毒性Aβ聚集形成的細(xì)胞外淀粉樣斑塊為特征的阿爾茲海默癥(AD)發(fā)病機(jī)制不清,究其原因主要為AD發(fā)病因素眾多,并且進(jìn)程中關(guān)鍵致病分子不明。本課題前期研究顯示,在構(gòu)建的AD患者全景式基因網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)DTL呈高水平狀態(tài)并與AD病理表征密切相關(guān),提示DTL及其編碼的蛋白Cdt2在AD發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。DTL為細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因,其編碼的蛋白Cdt2為一種E3-泛素化連接酶復(fù)合物的底物識(shí)別亞基,可促進(jìn)P21等底物的泛素化降解。P21為細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK,cyclin-dependentkinase)抑制因子,可通過(guò)與CDK結(jié)合從而抑制該激酶的活性。已有研究表明,在CDK家族中,CDK1和CDK5與AD發(fā)病高度相關(guān),均可作為tau蛋白上游激酶,通過(guò)促進(jìn)tau過(guò)度磷酸化導(dǎo)致神經(jīng)原纖維退變。CDK5誘發(fā)AD的研究報(bào)道更為廣泛,其過(guò)度激活可導(dǎo)致神經(jīng)元遷移、分化以及記憶鞏固發(fā)生障礙,參與AD神經(jīng)退行性病變。因此,本課題擬研究細(xì)胞周期關(guān)鍵基因DTL所編碼的E3-泛素化連接酶Cdt2,探討其是否在中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)促進(jìn)泛素化降解其底物P21,解除對(duì)CDK家族如CDK1或CDK5等活性的抑制作用,過(guò)度活化的CDKs又通過(guò)促進(jìn)其底物tau和APP等磷酸化,一方面導(dǎo)致tau過(guò)度磷酸化從而促進(jìn)神經(jīng)原纖維退變,另一方面APP過(guò)度磷酸化而更易被剪切成毒性Aβ并聚集形成淀粉樣斑塊。目的:探討Cdt2通過(guò)調(diào)節(jié)CDK活性參與AD的兩大特征性神經(jīng)病理學(xué)變化,闡明細(xì)胞周期關(guān)鍵基因DTL與AD的密切關(guān)系,為AD發(fā)病機(jī)制提供新線索。方法:通過(guò)大規(guī)模整合不同臨床癡呆程度AD病人和正常人死后尸檢樣本的海馬旁回、額下回、顳上回和內(nèi)嗅皮層四個(gè)腦區(qū),進(jìn)行RNA測(cè)序檢測(cè),獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)(來(lái)源于美國(guó)西奈山醫(yī)學(xué)院NIH神經(jīng)生物樣本庫(kù)MS-NBTR和AlzData數(shù)據(jù)庫(kù)),以分析DTL在AD人腦中的表達(dá)變化情況;在HEK293或HEK293/tau細(xì)胞中,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染空載或過(guò)表達(dá)Cdt2的質(zhì)粒48h,免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)P21的蛋白水平變化;應(yīng)用特異性抗體分別將CDK(1-5)從細(xì)胞裂解液中分離出來(lái),與底物Histone-1共孵育后,Western Blot檢測(cè)Histone-1 Ser/Thr磷酸化水平,以確定CDKs活性變化;收集以上轉(zhuǎn)染的細(xì)胞樣本,提取RNA,通過(guò)link-RNA測(cè)序,原始測(cè)序結(jié)果通過(guò)STAR測(cè)序儀(version2.5.0b)與人類hg19基因組進(jìn)行比對(duì),基于數(shù)據(jù)庫(kù)基因模型GRCh37.70,利用特征計(jì)數(shù)在基因水平進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析;在HEK293或HEK293/tau細(xì)胞中,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Cdt2 48h后再用CDK抑制劑Roscovitine(10μM)處理4h,通過(guò)Western Blot檢測(cè)tau的磷酸化水平,ELISA檢測(cè)可溶性Aβ42的水平,并通過(guò)Co-IP(蛋白質(zhì)免疫共沉淀)檢測(cè)CDK1和CDK5與APP的結(jié)合水平以及APP的磷酸化水平和APP與BACE1的結(jié)合水平,再通過(guò)link-RNA測(cè)序,進(jìn)行基因表達(dá)的定量分析,以確定CDK在Cdt2介導(dǎo)的AD病理學(xué)機(jī)制中的作用;包裝過(guò)表達(dá)Cdt2的腺相關(guān)病毒,腦立體定位注射于C57小鼠前額葉皮質(zhì)區(qū),感染一個(gè)月后,進(jìn)行Roscovitine(1OmM)干預(yù),通過(guò)曠場(chǎng)、新事物識(shí)別、水迷宮檢測(cè)動(dòng)物的情緒、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶等行為學(xué)變化情況,通過(guò)電生理檢測(cè)LTP,反映神經(jīng)元突觸可塑性,通過(guò)Western Blot檢測(cè)tau的磷酸化水平,ELISA檢測(cè)可溶性Aβ42的水平變化,高爾基染色分析神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)和數(shù)目的改變,以確定在動(dòng)物腦內(nèi),Cdt2過(guò)表達(dá)以及CDK抑制劑的干預(yù)對(duì)動(dòng)物AD樣病變的影響。結(jié)果:1.綜合海馬旁回、額下回、顳上回和內(nèi)嗅皮層四個(gè)腦區(qū)的數(shù)據(jù)(來(lái)源于美國(guó)西奈山醫(yī)學(xué)院NIH神經(jīng)生物樣本庫(kù)MS-NBTR和AlzData數(shù)據(jù)庫(kù)),分析結(jié)果顯示,DTL在AD人腦中的表達(dá)顯著上調(diào)。2.在過(guò)表達(dá)Cdt2的細(xì)胞中:①Western Blot結(jié)果顯示P21蛋白水平與對(duì)照組相比明顯下調(diào);②CDK(1-5)活性檢測(cè)結(jié)果顯示Histone-1磷酸化水平均有不同程度的升高,即Cdt2過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致CDK1,CDK2,CDK3,CDK4和CDK5活性上調(diào);③RNA測(cè)序結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)Cdt2組有2713個(gè)基因表達(dá)上調(diào),2760個(gè)基因表達(dá)下調(diào),在上調(diào)的差異表達(dá)基因中,CDK家族基因有三個(gè),在下調(diào)的差異表達(dá)基因中,有一個(gè)CDK家族基因和一個(gè)CDK抑制因子基因,并且還包括APOE、CASS4、CELF1、CLU和SORL1在內(nèi)的AD高風(fēng)險(xiǎn)基因發(fā)生了顯著性差異表達(dá)。3.在HEK293/tau細(xì)胞和C57小鼠中,過(guò)表達(dá)Cdt2后:①Western Blot結(jié)果顯示,tau Ser396位點(diǎn)的磷酸化水平明顯上調(diào);②ELISA結(jié)果顯示,可溶性Aβ42的水平明顯上調(diào);③Co-IP結(jié)果顯示,CDK1和CDK5與APP的結(jié)合水平、APP的磷酸化水平以及APP與BACE1的結(jié)合水平,在Cdt2過(guò)表組中均顯著上調(diào),而CDK抑制劑Ro sco vitine干預(yù)后,以上變化均有明顯恢復(fù)。4.link-RNA測(cè)序結(jié)果顯示,Roscovitine干預(yù)Cdt2過(guò)表達(dá)的細(xì)胞后,有超過(guò)5400個(gè)DTL過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的差異表達(dá)基因的表達(dá)水平得到逆轉(zhuǎn)。5.在C57小鼠中:①曠場(chǎng)、新事物識(shí)別、水迷宮檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Cdt2的小鼠的情緒和運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有受到影響,認(rèn)知功能明顯減弱;②LTP結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Cdt2的小鼠神經(jīng)元突觸可塑性顯著降低;③高爾基染色結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Cdt2的小鼠神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)發(fā)生退化,數(shù)目明顯減少,Roscovitine干預(yù)后,以上認(rèn)知以及神經(jīng)損傷均有明顯逆轉(zhuǎn)。6.將DTL過(guò)表達(dá)后的差異表達(dá)基因與調(diào)控AD的關(guān)鍵細(xì)胞周期子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)二者有顯著的重疊。結(jié)論:1.DTL在AD人腦中表達(dá)上調(diào),提示DTL與AD發(fā)病高度相關(guān);2.Cdt2可通過(guò)促進(jìn)P21泛素化降解,導(dǎo)致CDKs活性上調(diào);3.DTL過(guò)表達(dá)不僅可以影響諸多CDK家族蛋白的表達(dá),還影響了APOE、CASS4、CELF1、CLU和SORL1等AD高風(fēng)險(xiǎn)基因的表達(dá);4.Cdt2上調(diào)CDKs活性導(dǎo)致tau過(guò)度磷酸化和毒性Aβ增加;CDKs抑制劑可明顯逆轉(zhuǎn)Cdt2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙和基因表達(dá)改變;DTL可通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控參與AD發(fā)病。AD腦內(nèi)DTL/Cdt2過(guò)表達(dá)通過(guò)促進(jìn)泛素化降解其底物P21,解除對(duì)CDK家族如CDK1或CDK5等活性的抑制作用,一方面激活的CDKs導(dǎo)致tau過(guò)度磷酸化、促進(jìn)神經(jīng)原纖維退變,另一方面活化的CDKs磷酸化APP、促進(jìn)Aβ毒性,加重AD進(jìn)程。背景:鑒于阿爾茲海默癥(AD)發(fā)病機(jī)制和誘導(dǎo)因素多而復(fù)雜,多靶點(diǎn)定向配體(MTDLs)可能通過(guò)靶向多種發(fā)病機(jī)制、協(xié)同作用治療AD。藥用植物貫葉連翹提取物在AD動(dòng)物模型中的有益作用已被不斷報(bào)道,但貫葉連翹次生代謝產(chǎn)物中,特別是自其主要成分PPAPs(Polycyclic Polyprenylated AcylPhloroglucinols)衍生且具有新穎骨架的5種化合物(化合物1-5)是否也具有抗AD的生物活性及潛在的治療功效不明。目的:以BACE1和PP2A活性調(diào)節(jié)為靶點(diǎn),篩選并研究貫葉連翹次生代謝提取產(chǎn)物關(guān)鍵成分PPAPs的抗AD活性和藥用價(jià)值。方法:分別在N2a/APP和HEK293/tau細(xì)胞中,通過(guò)CCK8試劑盒檢測(cè)給藥處理后細(xì)胞活力,以評(píng)估分離提取自貫葉連翹的PPAPs中具有新穎骨架的5種衍生化合物(化合物1-5)毒性和安全濃度范圍;應(yīng)用試劑盒檢測(cè)BACE1和PP2A活性,分別計(jì)算化合物IC50和EC50,評(píng)估化合物調(diào)節(jié)BACE1和PP2A酶活的生物活性并進(jìn)行篩選;通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡和ELISA檢測(cè)tau蛋白磷酸化平和APP剪切以及毒性Aβ水平。在動(dòng)物水平,采用經(jīng)導(dǎo)管植入的腦立體定位注射于3 × Tg AD小鼠側(cè)腦室,連續(xù)給予化合物一個(gè)月,通過(guò)曠場(chǎng)、新事物識(shí)別和Morris水迷宮檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)記憶能力;用高爾基染色檢測(cè)樹(shù)突棘的數(shù)目;采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)化合物在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)BACE1和PP2A活性及毒性Aβ生成和tau磷酸化水平的影響。結(jié)果:細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示,分別在N2a/APP和HEK293/tau細(xì)胞水平,化合物1-5,處理濃度達(dá)到8μM時(shí)均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用,提示其具有較高安全性;在N2a/APP細(xì)胞中,與LY2811376(一種BACE1抑制劑陽(yáng)性對(duì)照藥,IC50為260.2nM)相比,化合物2和3能夠有效的抑制BACE1活性,IC50分別為136.2和98.62nM;在HEK293/tau細(xì)胞中,與SCR 1693(一種激活PP2A的陽(yáng)性對(duì)照藥,EC50為413.9 nM)相比,化合物2和3能夠有效激活PP2A,EC50分別為258.8和199nM;在細(xì)胞水平,化合物2和3均能有效的降低tau蛋白磷酸化水平、APP的β剪切以及毒性Aβ42水平,而化合物3效果更加顯著;并且,化合物3在減輕3 × Tg AD小鼠的病理和認(rèn)知損傷方面具有顯著的治療作用。結(jié)論:作為一種具有多功能骨架的先導(dǎo)化合物,化合物3既可激活PP2A,同時(shí)也能抑制BACE1,呈現(xiàn)出較好的抗AD特性,有望為AD藥物開(kāi)發(fā)提供依據(jù)和支持。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2679564