【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種多發(fā)生在老年、以認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。迄今為止,關(guān)于AD確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,針對AD的治療措施基本是改善認(rèn)知的癥狀性治療,而不能阻止或逆轉(zhuǎn)病情進(jìn)展。目前,血糖異常升高和糖尿病已被認(rèn)為是癡呆和AD的獨立危險因素,AD患者腦細(xì)胞葡萄糖與能量代謝顯著降低、而且明顯早于臨床癥候和特征性病理損害的形成。動物實驗研究也提示腦細(xì)胞葡萄糖代謝異�？赡苁茿D病理生理發(fā)生的關(guān)鍵因素,能量代謝下降影響腦功能狀態(tài)與線粒體功能,從而導(dǎo)致線粒體活性氧分子產(chǎn)生增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AD患者與腦細(xì)胞葡萄糖和能量代謝障礙有關(guān)的酶活性異常中,僅以硫胺素作為輔酶的α-酮戊二酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶和轉(zhuǎn)酮醇酶等活性下降最為明顯,且丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶的活性下降與AD臨床病情評定等級高度相關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查顯示,老年人群本身容易導(dǎo)致硫胺素缺乏,而且缺乏程度與認(rèn)知功能下降具有顯著相關(guān)性。另外,Gold等人的研究發(fā)現(xiàn),血硫胺素水平降低與散發(fā)性AD發(fā)病有關(guān),而與帕金森病無關(guān)。動物實驗研究也顯示,硫胺素缺乏促進(jìn)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠腦內(nèi)Aβ沉積。這提示機(jī)體硫胺素缺乏和/或代謝異常及硫胺素依賴的、與氧化代謝相關(guān)的線粒體酶活性下降可能與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此,我們認(rèn)為硫胺素缺乏或代謝異常誘發(fā)的α-酮戊二酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶活性下降、線粒體糖代謝和能量代謝障礙可能是AD發(fā)病的重要危險因素,可能直接參與AD特征性病理改變?nèi)鐃au蛋白異常磷酸化和Aβ沉積等。那么,硫胺素缺乏是否誘導(dǎo)正常野生型小鼠腦內(nèi)Aβ沉積等AD特征性病理損害形成呢?由于臨床試驗已經(jīng)證實硫胺素并不能治療或改變AD病程進(jìn)展,生物利用度更好和生理作用更為強(qiáng)大的硫胺素脂溶性衍生物是否可以改善線粒體功能與腦細(xì)胞能量代謝狀況、拮抗氧化損傷、減少AD特征性病理損害呢?由此我們利用8周齡正常野生型C57小鼠制備硫胺素缺乏動物模型,探討硫胺素缺乏對腦內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白磷酸化的影響;利用20周齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠,給予8周處理因素,觀察苯磷硫胺是否可提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及改善腦內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白異常磷酸化等病理改變。 第一部分硫胺素缺乏引起腦內(nèi)Aβ沉積和tau蛋白異常磷酸化的實驗研究 目的:探討硫胺素缺乏對腦內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白磷酸化的影響。 方法:硫胺素剝奪飲食結(jié)合腹腔注射吡啶硫胺制作硫胺素缺乏動物模型,正常對照組給予正常飲食及腹腔注射生理鹽水。造模13d后取腦,行HE染色觀察兩組動物腦內(nèi)易損區(qū)域病理改變,免疫組織化學(xué)染色檢測腦內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白磷酸化及β-分泌酶的表達(dá)情況。 結(jié)果:HE染色顯示硫胺素缺乏模型組小鼠內(nèi)側(cè)丘腦出現(xiàn)典型的對稱性針尖樣出血;免疫組化顯示模型組小鼠皮層、海馬及丘腦均出現(xiàn)Aβ沉積,且丘腦Aβ沉積較皮層及海馬更為明顯,tau蛋白磷酸化及β-分泌酶的陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加。正常對照組小鼠HE染色腦內(nèi)未見病理損傷,皮層、海馬及丘腦均未發(fā)現(xiàn)Aβ沉積,tau蛋白磷酸化及表達(dá)β-分泌酶的陽性細(xì)胞數(shù)均明顯低于硫胺素缺乏模型組,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:硫胺素缺乏可引起腦內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白磷酸化增加等AD特征性的病理改變,且Aβ沉積可能與上調(diào)β-分泌酶的表達(dá)有關(guān)。 第二部分苯磷硫胺改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠行為學(xué)及阿爾茨海默病相關(guān)病理改變的實驗研究 目的:觀察苯磷硫胺是否改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降及腦內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白異常磷酸化等病理改變 方法:20周齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠,隨機(jī)分為苯磷硫胺高劑量組(200mg/kg)、苯磷硫胺中劑量組(100mg/kg)、苯磷硫胺低劑量組(50mg/kg)、石衫堿甲組(66.7ug/kg)、呋喃硫胺組(100mg/kg)、空白對照組。各組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠以0.2ml/10g的藥物容積按應(yīng)給予劑量的藥液灌胃(i.g)給藥,每天1次,連續(xù)8w。最后1次給藥1h后,每組半數(shù)動物進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練,其余半數(shù)動物經(jīng)水合氯醛麻醉,生理鹽水、多聚甲醛依次灌注后取腦。免疫組化染色觀察腦內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白磷酸化情況。 結(jié)果:第5天撤臺實驗中,200、100mg/kg苯磷硫胺組及石杉堿甲組明顯增加了小鼠穿越平臺的次數(shù),與模型組相比P0.01;50mg/kg苯磷硫胺組和呋喃硫胺組雖然也增加了小鼠的穿臺次數(shù),但與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)的顯著性差異。在第Ⅳ象限游泳的路程和時間指標(biāo)上,與模型組相比,200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg苯磷硫胺組及石杉堿甲組均明顯增加了小鼠在平臺周圍活動的路程和時間,說明以上各組藥物明顯改善了動物尋找平臺的學(xué)習(xí)記憶狀況;呋喃硫胺組沒有明顯改變上述兩個指標(biāo)�？瞻讓φ战M小鼠腦內(nèi)的Aβ沉淀斑點較多;石杉堿甲和呋喃硫胺給藥組腦內(nèi)的Aβ沉淀斑點數(shù)量與空白對照組相比無明顯差異;50mg/kg的苯磷硫胺減少了AD小鼠腦內(nèi)的Aβ沉淀斑點數(shù)量,與空白對照組相比P0.05;100、200mg/kg的苯磷硫胺組小鼠腦內(nèi)的Aβ沉淀斑點鏡下直觀均明顯減少,統(tǒng)計結(jié)果顯示P0.01。應(yīng)用p-tau(Ser396)抗體行免疫組化染色半定量方法檢測腦內(nèi)tau蛋白磷酸化情況。在200倍鏡下計數(shù)皮層p-tau陽性的細(xì)胞個數(shù),發(fā)現(xiàn)空白對照組小鼠腦內(nèi)p-tau陽性的細(xì)胞個數(shù)較多,呋喃硫胺給藥組腦內(nèi)的p-tau陽性的細(xì)胞個數(shù)與空白對照組相比無明顯差異;石杉堿甲組腦內(nèi)的p-tau陽性的細(xì)胞個數(shù)少于空白對照組,P0.05;50、100、200mg/kg的苯磷硫胺組小鼠腦內(nèi)的p-tau陽性的細(xì)胞個數(shù)鏡下直觀均明顯減少,與空白對照組相比,統(tǒng)計結(jié)果顯示P0.01。 結(jié)論:苯磷硫胺顯示出明顯改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及減少腦內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白磷酸化等病理改變的作用。
【圖文】：

應(yīng)用兔抗鼠A隊:抗體進(jìn)行免疫組化染色檢測腦內(nèi)Ap沉積情況，發(fā)現(xiàn)TD模型組小鼠皮層、海馬及丘腦均可見片狀A(yù)p沉積，且丘腦處Ap沉積較皮層及海馬結(jié)構(gòu)更為明顯，而CTL組小鼠腦內(nèi)以上結(jié)構(gòu)均未見Ap沉積(圖1一2)。皮層C0l’te籠海馬 hiPpoeamPus丘腦thalamUS正常對照組CTL硫胺素缺乏組硫膠素缺乏組TD圖1一2硫胺素缺乏引起腦內(nèi)Ap沉積(Ap4:抗體染色示老年斑，A一F200x，G一H4oox)A一c示正常對照組小鼠皮層、海馬、丘腦，未見Ap沉積;

海馬及丘腦tau蛋白磷酸化陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多。對p一tau(ser396)陽性細(xì)胞個數(shù) /4OOX視野進(jìn)行統(tǒng)計，，計數(shù)顯示:CTL組6.余3.77，TD組16.9土3.82，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1一5、1一6)。皮層CorteX海馬hipPocampus丘腦th皿I腸幻口us CTLTD
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R749.16

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本文編號：2670276