【摘要】：背景:抑郁癥是一種以持續(xù)性情緒障礙為主要特征的精神疾病,嚴(yán)重影響著人們的健康生活。盡管近年來(lái)神經(jīng)藥理學(xué)在精神病學(xué)領(lǐng)域取得了進(jìn)步,但抑郁癥的治療仍然是醫(yī)學(xué)界面臨的重大挑戰(zhàn)。目前大多數(shù)臨床抗抑郁藥物主要通過(guò)對(duì)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控發(fā)揮作用,但這類(lèi)藥物具有療效低、起效慢以及具有藥物耐受性等缺點(diǎn)。因此,進(jìn)一步研究抑郁癥的病理機(jī)制可以為研發(fā)新型抗抑郁藥物提供重要的靶點(diǎn)和理論支持。前人的研究發(fā)現(xiàn)抑郁患者的前扣帶回皮層(Anterior Cingulate Cortex,ACC)功能減弱,含生長(zhǎng)抑制素(Somatostatin,SST)的γ-氨基丁酸(Gamma-Aminobutyric Acid,GABA)能中間神經(jīng)元在ACC腦區(qū)表達(dá)降低,抗抑郁治療能夠使腦內(nèi)GABA濃度升高以及GABA受體活動(dòng)性增強(qiáng)。在抗抑郁藥物的研究中也發(fā)現(xiàn),含小清蛋白(Parvalbumin,PV)的GABA能中間神經(jīng)元也可能介導(dǎo)了抗抑郁作用。這些發(fā)現(xiàn)表明,ACC腦區(qū)GABA能中間神經(jīng)元的活動(dòng)可能是抗抑郁機(jī)制研究的一個(gè)重要靶點(diǎn)。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),非選擇性M型膽堿能受體(Muscarinic Cholinergic Receptor,m ACh R)拮抗劑—東莨菪堿(Scopolamine,Sco)具有快速且顯著的抗抑郁作用,但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確,進(jìn)一步揭示其具體的作用機(jī)制可以為抗抑郁藥物的研發(fā)提供重要的理論依據(jù)。因此本研究提出的問(wèn)題是m ACh R活動(dòng)是否會(huì)影響ACC腦區(qū)GABA能中間神經(jīng)元上的突觸傳遞功能?本研究通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)、免疫組化以及膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)等方法,探討了激活和拮抗m ACh R活動(dòng)對(duì)ACC腦區(qū)GABA能中間神經(jīng)元突觸傳遞功能的影響,為揭示快速抗抑郁藥物Sco的具體作用機(jī)制提供理論支持。方法:1、使用SST-Cre和PV-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Ai9-RFP(Red Fluorescent Protein,RFP)轉(zhuǎn)基因小鼠交配,獲得SST-Cre:Ai9-RFP和PV-Cre:Ai9-RFP小鼠。通過(guò)免疫組化的方法確定兩類(lèi)小鼠分別在ACC腦區(qū)SST中間神經(jīng)元和PV中間神經(jīng)元上特異性表達(dá)RFP。2、利用膜片鉗全細(xì)胞(Whole-cell Patch-calmp)記錄技術(shù),在SST-Cre:Ai9-RFP和PV-Cre:Ai9-RFP小鼠離體腦片ACC腦區(qū)記錄表達(dá)RFP的神經(jīng)元電生理特性,包括靜息膜電位(Resting Membrane Potential,RMP)、輸入阻抗(Input resistance)、動(dòng)作電位(Action Potential,AP)的閾值(Threshold)、AP中位寬度(Half-width)、AP幅值(Amplitude)、超極化后電位(Afterhyperpolarization,AHP)、放電起始(Initial)和穩(wěn)定頻率(Steady)、放電頻率適應(yīng)性(Spike frequency adaptation),并通過(guò)生物素染色觀(guān)察神經(jīng)元的形態(tài)特征。3、在SST-Cre:Ai9-RFP和PV-Cre:Ai9-RFP小鼠ACC腦區(qū)熒光標(biāo)記的SST和PV中間神經(jīng)元上,分別記錄自發(fā)性興奮性突觸后電流(spontaneous Excitatory Postsynaptic Currents,s EPSCs)、微小興奮性突觸后電流(miniature Excitatory Postsynaptic Currents,m EPSCs)、微小抑制性突觸后電流(miniature Inhibitory Postsynaptic Currents,m IPSCs),觀(guān)察m ACh R激動(dòng)劑Muscarine(10μM)和拮抗劑Sco(100n M)對(duì)突觸傳遞的影響。結(jié)果:1、免疫組化結(jié)果顯示,SST-Cre:Ai9-RFP小鼠ACC腦區(qū),表達(dá)RFP的神經(jīng)元中有81%與SST抗體共標(biāo);PV-Cre:Ai9-RFP小鼠的ACC腦區(qū)的表達(dá)RFP的神經(jīng)元中有83%與PV抗體共標(biāo)。2、SST-Cre:Ai9-RFP小鼠表達(dá)RFP的神經(jīng)元的電生理特性(n=35):靜息膜電位-69.54±0.7m V,輸入阻抗319.0±22.69MΩ,AP閾值-35.66±0.97m V、中位寬度0.38±0.02ms、幅值83.36±1.96p A、超極化后電位20.22±0.84m V,起始頻率111.4±7.02Hz;穩(wěn)定頻率40.44±3.33Hz,放電頻率適應(yīng)性3.43±0.48;PV-Cre:Ai9-RFP小鼠表達(dá)RFP的神經(jīng)元的電生理特性(n=35):靜息膜電位-73.14±0.52m V;輸入阻抗180.7±9.68MΩ;AP發(fā)生的閾值-27.06±0.81m V;中位寬度0.26±0.01ms、幅值73.31±1.35p A;超極化后電位25.62±0.54m V;起始頻率111.9±9.60Hz;穩(wěn)定頻率80.91±5.74Hz;放電頻率適應(yīng)性1.35±0.06。SST-Cre:Ai9-RFP小鼠表達(dá)RFP的神經(jīng)元多呈梭形,具有雙極或三極形態(tài);PV-Cre:Ai9-RFP小鼠表達(dá)RFP的神經(jīng)元多呈籃形,且具有多極形態(tài)。3、灌流Muscarine激活m ACh R后,ACC腦區(qū)SST中間神經(jīng)元的s EPSCs頻率顯著增加(p0.01),而幅值變化差異不顯著,該作用可以被Sco阻斷(p0.01);單獨(dú)灌流Sco不顯著影響s EPSCs和m EPSCs的頻率和幅值;Muscarine能夠使SST中間神經(jīng)元m IPSCs的頻率顯著降低(p0.05)而不顯著影響幅值,該作用可以被Sco阻斷(p0.05);單獨(dú)灌流Sco,SST中間神經(jīng)元m IPSCs的頻率顯著增加(p0.05)但不影響其幅值。4、灌流Muscarine激活m ACh R后,ACC腦區(qū)PV中間神經(jīng)元的s EPSCs頻率顯著增加(p0.05),而幅值變化不顯著,該作用可以被m ACh R拮抗劑Sco、阻斷(p0.05);單獨(dú)灌流Sco不顯著影響s EPSCs和m EPSCs的頻率和幅值;灌流Muscarine激活m ACh R對(duì)PV中間神經(jīng)元m IPSCs的頻率和幅值的影響均不顯著;單獨(dú)灌流Sco對(duì)PV中間神經(jīng)元m IPSCs的頻率和幅值影響不顯著。結(jié)論:1、結(jié)合免疫組化結(jié)果、神經(jīng)元電生理特性和形態(tài)特征,基本確定我們記錄的ACC腦區(qū)表達(dá)RFP的神經(jīng)元為SST中間神經(jīng)元和PV中間神經(jīng)元。2、激活m ACh R可以增強(qiáng)ACC腦區(qū)SST中間神經(jīng)元和PV中間神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞功能,而拮抗m ACh R對(duì)SST中間神經(jīng)元和PV中間神經(jīng)元興奮性突觸傳遞功能影響均不顯著。3、激活m ACh R可以減弱ACC腦區(qū)SST中間神經(jīng)元的抑制性突觸傳遞,但不影響PV中間神經(jīng)元的抑制性突觸傳遞;拮抗m ACh R可以增強(qiáng)SST中間神經(jīng)元的抑制性突觸傳遞功能,但不影響PV中間神經(jīng)元的抑制性突觸傳遞功能。4、本研究的結(jié)果提示,m ACh R活動(dòng)對(duì)ACC腦區(qū)SST和PV中間神經(jīng)元上的突觸傳遞功能有不同的影響。這些不同影響在快速抗抑郁中有何作用亟待進(jìn)一步的研究。
【圖文】：

圖 1 本研究實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)圖2.3 研究意義及創(chuàng)新之處由于現(xiàn)行抗抑郁藥物存在各種缺點(diǎn)（療效低、起效慢、易產(chǎn)生耐受性），而東莨菪堿具有與傳統(tǒng)抗抑郁藥物不同的快速且顯著的抗抑郁作用，進(jìn)一步明確其具體作用機(jī)制，可以為研發(fā)新的抗抑郁藥物提供一定的理論支持。了解 mAChR 活動(dòng)對(duì) ACC 腦區(qū) SST 中間神經(jīng)元和 PV 中間神經(jīng)元突觸傳遞功能的影響，可以為東莨菪堿的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。以往的研究中對(duì)東莨菪堿的作用機(jī)制問(wèn)題大多是在 PFC 上進(jìn)行的，且沒(méi)有同時(shí)對(duì) SST 中間神經(jīng)元和 PV 中間神經(jīng)元進(jìn)行電生理記錄的研究。在研究中，對(duì)兩類(lèi)中間神經(jīng)元的特異性標(biāo)記很重要。本研究利用 Cre-loxp了系統(tǒng)，獲得 ACC 腦區(qū)神經(jīng)元被紅色熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠 SST-Cre：Ai9-RFP和 PV-Cre：Ai9-RFP 小鼠，可以得在離體腦片狀態(tài)下結(jié)合紅色熒光準(zhǔn)確識(shí)別出兩類(lèi)神經(jīng)元。通過(guò)免疫組化、神經(jīng)元電生理特性及形態(tài)特征確認(rèn)表達(dá) RFP 的神經(jīng)元屬于 SST 中間神經(jīng)元和 PV 中間神經(jīng)元。之后使用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，通過(guò)

4、結(jié)果、結(jié)果.1 SST-Cre：Ai9-RFP 小鼠和 PV-Cre：Ai9-RFP 小鼠 ACC 腦區(qū) SST 和V 中間神經(jīng)元表達(dá) RFP 的特異性如圖 2 所示，在熒光顯微鏡下觀(guān)察到，在 SST-Cre：Ai9-RFP 小鼠及 PV-Crei9-RFP 小鼠的 ACC 腦區(qū)，，廣泛表達(dá)紅色熒光蛋白（Red Fluorescent Protein，RFP）神經(jīng)元。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R749.4

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本文編號(hào)：2669825