【摘要】： 目的 阿爾茨海默病(AD)是老年性智力障礙與癡呆最常見的癡病。臨床上以進行性記憶功能及認知功能的下降為特征,嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。目前該病的治療主要是以對癥治療為主,尚無特效的治療手段。因此關于阿爾茨海默病的研究具有重要意義。阿爾茨海默病確切的病因還不是很明確,目前以β淀粉樣蛋白(Aβ)瀑布學說為主,該學說認為β淀粉樣蛋白在大腦皮質(zhì)、海馬、嗅球等相關區(qū)域的異常大量沉積是導致阿爾茨海默病整個病理過程的最初和最關鍵步驟,而其他病理過程以及tau蛋白的過磷酸化都繼之于此。一旦Aβ尤其以Aβ42為主異常沉積將會對腦細胞產(chǎn)生毒性作用,引起組織變性。一些Aβ免疫措施已經(jīng)在AD模型鼠中實施,并發(fā)現(xiàn)有重要的臨床研究價值。理論上主動及被動免疫都可以清除Aβ斑塊,早期用Aβ免疫AD轉基因鼠證實其能降低Aβ的病理沉積、推遲認知功能損害及改善記憶功能�；诖罅縿游飳嶒灲Y果,Ⅰ期臨床試驗在20個患者中實施。不幸的是Ⅱ期臨床試驗298人中有18人約6%產(chǎn)生了副反應—自身免疫性無菌性腦脊髓膜炎。目前已有研究認為Ⅱ期臨床實驗中的副反應可能與AβC-末端含有T細胞抗原表位導致了T細胞過度反應有關,因此在設計疫苗時應重點針對B細胞抗原決定簇以減少或消除T細胞反應。研究者應用N-末端片斷免疫的結果表明小分子N-末端片段作為疫苗能有效清除Aβ斑塊,并能避免炎癥反應。因此我們構建的Aβ亞單位疫苗在設計上避免了T細胞的抗原決定簇,保留了B細胞抗原決定簇。盡管AD的免疫治療遭遇挫折,但隨著研究的深入發(fā)展,又給AD患者帶來新的希望。疫苗沒有引起動物的自身免疫反應,也不會影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。研究發(fā)現(xiàn)普遍存在于細菌DNA中的非甲基化CPG序列具有強烈的免疫增強效應,人工合成CPG序列的寡核苷酸能夠模擬細菌DNA中CPG的生物功能。其與蛋白類抗原聯(lián)合應用可以有效的誘導機體產(chǎn)生免疫應答,具有免疫佐劑的作用。另外研究證實小肽段多次重復從而延長肽鏈能增強其抗原性。鑒于目前小肽段免疫原性弱的缺點,我們在實驗設計中采用多次重復序列及同時應用CPGDNA,以提高重組子的免疫原性。為了尋求更安全,有效的疫苗我們構建阿爾茨海默病Aβ3-10和CPG基因表達質(zhì)粒,探討其是否能作為阿爾茨海默病的特異性疫苗,為進一步研究Aβ清除老年斑的機理和DNA疫苗的研制奠定了基礎。 方法 在GenBank中查到Aβ3-10的cDNA序列,人工合成Aβ3-10-CPG基因片段上游加上cozak序列及上下游加酶切位點(上-EcoRI下-XhoI),CPG序列前加入酶切位點NotI,人工合成目的基因。以限制性內(nèi)切酶EcoRV將POC57質(zhì)粒切成平端,連接酶連接構建POC57-Aβ3-10-CpG載體,轉化感受態(tài)菌DH-5α,挑取陽性克隆,質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,測序驗證。選擇測序正確的與pcDNA3.1載體進行酶切,而后進行電泳,膠回收,用回收產(chǎn)物連接,轉化感受態(tài)菌DH-5α,挑克隆測序。 結果 經(jīng)測序證實成功構建pcDNA3.1+-Aβ3-10-CpG真核表達載體。 結論 成功構建pcDNA3.1+-Aβ3-10-CpG真核表達載體�？蓪⑵渥鳛榘柎暮Ｄ〉暮蜻x疫苗,為真核細胞表達及轉基因動物體內(nèi)試驗提供了依據(jù),也為進一步研究主動免疫清除老年斑的機理奠定了基礎,為阿爾茨海默病基因疫苗的研制提供了新的手段。
【圖文】：

真核細胞表達載體peDNA3.1書Ap3一10一CpG的構建經(jīng)PCR及基因測序驗經(jīng) NICBBLAST軟件驗證與目的片斷無誤。圖1:PCR方法擴增合成目的基因的電泳結果，與 DNAMark對比DNA分子量與目的基因一致(M為DNAMark條帶，O為合成目的基因條帶)

MO圖2，圖3，，pOC57一Ap3一10·CpG陽性細菌克隆PeR產(chǎn)物的電泳結果M0 peDNA3.1書Ap3一10一CpG陽性細菌克隆PCR產(chǎn)物的電泳結果
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R749.16

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6 李e

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