【摘要】： 目的 阿爾茨海默病(AD)是老年性智力障礙與癡呆最常見的癡病。臨床上以進(jìn)行性記憶功能及認(rèn)知功能的下降為特征,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。目前該病的治療主要是以對癥治療為主,尚無特效的治療手段。因此關(guān)于阿爾茨海默病的研究具有重要意義。阿爾茨海默病確切的病因還不是很明確,目前以β淀粉樣蛋白(Aβ)瀑布學(xué)說為主,該學(xué)說認(rèn)為β淀粉樣蛋白在大腦皮質(zhì)、海馬、嗅球等相關(guān)區(qū)域的異常大量沉積是導(dǎo)致阿爾茨海默病整個病理過程的最初和最關(guān)鍵步驟,而其他病理過程以及tau蛋白的過磷酸化都繼之于此。一旦Aβ尤其以Aβ42為主異常沉積將會對腦細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,引起組織變性。一些Aβ免疫措施已經(jīng)在AD模型鼠中實(shí)施,并發(fā)現(xiàn)有重要的臨床研究價值。理論上主動及被動免疫都可以清除Aβ斑塊,早期用Aβ免疫AD轉(zhuǎn)基因鼠證實(shí)其能降低Aβ的病理沉積、推遲認(rèn)知功能損害及改善記憶功能�；诖罅縿游飳�(shí)驗(yàn)結(jié)果,Ⅰ期臨床試驗(yàn)在20個患者中實(shí)施。不幸的是Ⅱ期臨床試驗(yàn)298人中有18人約6%產(chǎn)生了副反應(yīng)—自身免疫性無菌性腦脊髓膜炎。目前已有研究認(rèn)為Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)中的副反應(yīng)可能與AβC-末端含有T細(xì)胞抗原表位導(dǎo)致了T細(xì)胞過度反應(yīng)有關(guān),因此在設(shè)計疫苗時應(yīng)重點(diǎn)針對B細(xì)胞抗原決定簇以減少或消除T細(xì)胞反應(yīng)。研究者應(yīng)用N-末端片斷免疫的結(jié)果表明小分子N-末端片段作為疫苗能有效清除Aβ斑塊,并能避免炎癥反應(yīng)。因此我們構(gòu)建的Aβ亞單位疫苗在設(shè)計上避免了T細(xì)胞的抗原決定簇,保留了B細(xì)胞抗原決定簇。盡管AD的免疫治療遭遇挫折,但隨著研究的深入發(fā)展,又給AD患者帶來新的希望。疫苗沒有引起動物的自身免疫反應(yīng),也不會影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。研究發(fā)現(xiàn)普遍存在于細(xì)菌DNA中的非甲基化CPG序列具有強(qiáng)烈的免疫增強(qiáng)效應(yīng),人工合成CPG序列的寡核苷酸能夠模擬細(xì)菌DNA中CPG的生物功能。其與蛋白類抗原聯(lián)合應(yīng)用可以有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,具有免疫佐劑的作用。另外研究證實(shí)小肽段多次重復(fù)從而延長肽鏈能增強(qiáng)其抗原性。鑒于目前小肽段免疫原性弱的缺點(diǎn),我們在實(shí)驗(yàn)設(shè)計中采用多次重復(fù)序列及同時應(yīng)用CPGDNA,以提高重組子的免疫原性。為了尋求更安全,有效的疫苗我們構(gòu)建阿爾茨海默病Aβ3-10和CPG基因表達(dá)質(zhì)粒,探討其是否能作為阿爾茨海默病的特異性疫苗,為進(jìn)一步研究Aβ清除老年斑的機(jī)理和DNA疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。 方法 在GenBank中查到Aβ3-10的cDNA序列,人工合成Aβ3-10-CPG基因片段上游加上cozak序列及上下游加酶切位點(diǎn)(上-EcoRI下-XhoI),CPG序列前加入酶切位點(diǎn)NotI,人工合成目的基因。以限制性內(nèi)切酶EcoRV將POC57質(zhì)粒切成平端,連接酶連接構(gòu)建POC57-Aβ3-10-CpG載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH-5α,挑取陽性克隆,質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,測序驗(yàn)證。選擇測序正確的與pcDNA3.1載體進(jìn)行酶切,而后進(jìn)行電泳,膠回收,用回收產(chǎn)物連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH-5α,挑克隆測序。 結(jié)果 經(jīng)測序證實(shí)成功構(gòu)建pcDNA3.1+-Aβ3-10-CpG真核表達(dá)載體。 結(jié)論 成功構(gòu)建pcDNA3.1+-Aβ3-10-CpG真核表達(dá)載體�？蓪⑵渥鳛榘柎暮Ｄ〉暮蜻x疫苗,為真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)試驗(yàn)提供了依據(jù),也為進(jìn)一步研究主動免疫清除老年斑的機(jī)理奠定了基礎(chǔ),為阿爾茨海默病基因疫苗的研制提供了新的手段。
【圖文】：

真核細(xì)胞表達(dá)載體peDNA3.1書Ap3一10一CpG的構(gòu)建經(jīng)PCR及基因測序驗(yàn)經(jīng) NICBBLAST軟件驗(yàn)證與目的片斷無誤。圖1:PCR方法擴(kuò)增合成目的基因的電泳結(jié)果，與 DNAMark對比DNA分子量與目的基因一致(M為DNAMark條帶，O為合成目的基因條帶)

MO圖2，圖3，，pOC57一Ap3一10·CpG陽性細(xì)菌克隆PeR產(chǎn)物的電泳結(jié)果M0 peDNA3.1書Ap3一10一CpG陽性細(xì)菌克隆PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R749.16

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6 李e

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