【摘要】：AD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,是導(dǎo)致老年人癡呆的主要原因。據(jù)統(tǒng)計:美國AD患者為200-400萬,全球1700-2500萬。據(jù)最新城市普查結(jié)果,AD患病率高于血管性癡呆。在西方國家AD是繼心臟病、腫瘤和中風之后,排在第四位的導(dǎo)致死亡的疾病。AD可延續(xù)20年,給個人、家庭、社會帶來深重的負擔和痛苦。AD的病因尚不明確,因此使得其治療變得更為困難,目前針對這類患者尚未有十分有效的治療方案�，F(xiàn)有的研究表明,Aβ、Tau、PS和ApoE等均在AD的發(fā)病過程中起到重要作用,但令人遺憾的是,以上述幾個方面做為靶點的治療未能取得令人滿意的效果。因此,我們有必要從新的角度來研究AD的發(fā)病機制,從而為其治療提供新的思路。microRNAs(miRNAs)是一種內(nèi)源性表達的非編碼小RNA,其通過抑制靶mRNA的翻譯或促進靶mRNA的降解調(diào)節(jié)基因的表達。隨著對其研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)miRNAs在各種生理或病理過程發(fā)揮著日益重要的作用。miRNA在腦組織中含量豐富,而且有些miRNA是腦組織所特有的,例如mir-124a和mir-134。miRNAs對于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和突觸可塑性的形成起著重要作用。目前已有相關(guān)研究表明,miRNA功能的異常可能參與了各種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生,包括帕金森病和阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)等。但是,miRNAs在AD中的具體作用機制目前還不明確。 mir-34a是mir-34家族的一個成員,這一家族包括3種互相關(guān)聯(lián)的miRNAs:mir-34a、mir-34b和mir-34c。其中mir-34a由位于1號染色體p36.23的基因編碼,而mir-34b/mir-34c基因簇則由位于11號染色體q23的基因編碼。已有多篇文獻報道m(xù)ir-34a可以通過誘導(dǎo)細胞周期停滯、凋亡或老化抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外,在人神經(jīng)母細胞瘤和其它惡性腫瘤中,經(jīng)常會出現(xiàn)mir-34a編碼基因的雜合性缺失。目前,還未見有關(guān)mir-34a在AD中作用機制的報道。 Bcl2是一種抗凋亡蛋白,其通過與Apaf-1的結(jié)合抑制caspase-9的活性。已有研究表明,在阿爾茨海默病中,bcl2可以通過抑制caspase-9和caspase-3的活性來保護神經(jīng)細胞免于凋亡或減輕病變程度。Caspase-3和caspase-9都是介導(dǎo)凋亡的重要因子,此外也有研究表明caspase-9和caspase-3可以促進Tau和APP的剪切,從而導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成和細胞外淀粉樣斑塊的沉積。 我們利用APPswe/PSΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究阿爾茨海默病的模型,通過microRNA芯片和螢光定量PCR的方法,發(fā)現(xiàn)mir-34a在模型小鼠中表達水平明顯升高,并且其表達水平與bcl2蛋白水平呈負相關(guān)。為了進一步研究兩者之間的關(guān)系,我們構(gòu)建了mir-34a的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,通過對這一細胞系的研究表明mir-34a過表達可以明顯降低bcl2蛋白水平,但是其mRNA水平無明顯變化,這提示我們bcl2很有可能是mir-34a的一個作用靶點。為了進一步驗證我們的想法,我們利用針對mir-34a的反義寡核苷酸序列來抑制mir-34a的表達,并分析其對bcl2蛋白表達的影響,實驗結(jié)果與我們預(yù)想的一致,當mir-34表達降低以后,bcl2蛋白水平明顯升高,其mRNA水平無明顯改變,這一結(jié)果進一步提示我們mir-34a可能作用于bcl2.為了證明bcl2 mRNA的3'UTR序列包含mir-34a作用的位點,我們將bcl2 mRNA的3'UTR序列克隆至螢光報告載體中,并與mir-34a表達載體共轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細胞中,然后檢測螢光素酶的活性,結(jié)果表明mir-34a的過表達可以明顯抑制抑制螢光素酶的活性;與之相反,當我們將bel2 3'UTR-螢光素酶報告載體中mir-34a可能的結(jié)合位點采用定點突變的方法突變以后,再和mir-34a表達載體共轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細胞中,螢光素酶的活性僅發(fā)生微弱的變化,這說明mir-34a可以直接作用于bel2。 除了證明mir-34a和bcl2的關(guān)系以外,我們還檢測了活化的caspase-9和caspase-3的表達情況。我們發(fā)現(xiàn)無論是在APPswe/PSΔE9小鼠中,還是在mir-34a的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中,活化的aspase-3和caspase-9的表達水平都明顯升高。當我們抑制mir-34a表達以后,bcl2表達水平升高,與此同時,活化的caspase-3和caspase-9的蛋白水平明顯降低,上述結(jié)果提示我們mir-34a可以通過調(diào)節(jié)bcl2的表達水平來影響caspase-3和caspase-9的激活。無論是bcl2還是caspase-3和caspase-9,它們都參與了AD的發(fā)生,我們的實驗結(jié)果提示我們bcl2可能是mir-34a重要的功能靶點,mir-34a的過表達可能通過下調(diào)bcl2的蛋白水平,從而參與AD的發(fā)生。
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R749.161

【引證文獻】

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1 曹婷;楊麗君;崔紅;;微小RNA在神經(jīng)系統(tǒng)及髓鞘發(fā)生的調(diào)節(jié)作用[J];首都醫(yī)科大學學報;2012年03期

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本文編號：2665506