【摘要】： 目的： (1)制備納米微粒基因載體，探討其結(jié)合、保護(hù)DNA的優(yōu)勢(shì)。 (2)分析精神分裂癥模型動(dòng)物NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞因子變化，從免疫學(xué)方面探討精神分裂癥的病理機(jī)制。 (3)探討納米微粒載NF-κB圈套基因作用于精神分裂癥模型動(dòng)物后對(duì)NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞因子的干預(yù)效果。 方法： (1)運(yùn)用乳化聚合法通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合正交分析優(yōu)化制備條件，制作合適平均粒徑PBCA納米微粒，并對(duì)其進(jìn)行表面改性，制備適合作為納米微�；蜉d體的納米微粒。 (2)利用納米微粒作為基因載體結(jié)合啞鈴型NF-κB圈套基因，制成納米微粒載NF-κB圈套基因。 (3)利用體重為350±20g雄性wistar大鼠，注射0.3mg／kg、0.6mg／kg、1.2 mg／kg、1.8 mg／kg、2.4 mg／kg不同劑量MK-801，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為變化，優(yōu)化模型制作的最佳劑量，建立精神分裂癥動(dòng)物模型。 (4)利用納米微粒載NF-κB圈套基因通過(guò)側(cè)腦室注射抑制NF-κB蛋白活性，考察動(dòng)物在行為學(xué)上的變化，同時(shí)考察納米微粒載圈套基因?qū)NF-α、ILlp、IL-2、IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)的影響。 數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包處理。 結(jié)果： (1)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定制備平均粒徑74±3nm納米微粒(NP)的制備條件：反應(yīng)溶液pH值為2.5，BCA單體濃度為1％，攪拌速度為1000r／min，表面活性劑為1％的Dextran70，，添加0.3％的Tween-80，在25℃反應(yīng)3h，調(diào)節(jié)pH值在6～7之間，繼續(xù)攪拌1h終止。所制NP為均勻球形，表面平滑完整，粒徑分布呈正態(tài)分布，分布均勻，跨度僅在0.21左右，分散良好。 (2)采用0.25％CTAB對(duì)空白PBCA-NP進(jìn)行表面改性，Zeta電位從-23.0mV提高到+23mV。MTT法測(cè)定細(xì)胞毒性，PBCA-NP和CTAB-PBCA-NP均在≤100nng／μl時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。 (3)經(jīng)過(guò)表面改性的NP在pH值7.0條件下可以質(zhì)量比10∶1與啞鈴型NF-κB圈套基因結(jié)合，包封率為96.21％，結(jié)合后并未引起NP表面形態(tài)和平均粒徑的改變。與NP結(jié)合以后基因片段抗DNaseⅠ、血清降解，超聲破壞的能力得到了顯著的提高。 (4)經(jīng)過(guò)劑量實(shí)驗(yàn)，注射劑量為0.6mg／kg，注射體積100μl／20g可以誘發(fā)較為典型的精神分裂癥癥狀，運(yùn)動(dòng)增加、刻板行為明顯、存在一定程度的共濟(jì)失調(diào)，社會(huì)行為淡漠。同時(shí)大鼠仍然保持一定的行為能力未出現(xiàn)中毒癥狀。 (5)納米微粒載NF-κB圈套基因在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中以較高的效能抑制了NF-κB的活性，與裸圈套基因相比有顯著水平的差異(P=0.0324)。利用納米微粒載NF-BB圈套基因作用MK-80l模型大鼠，抑制NF-κB的活性，表現(xiàn)出了較好的抑制效應(yīng)。 (6)納米微粒載NF-κB圈套基因作用MK-801模型大鼠后大鼠的行為發(fā)生了顯著的變化，MK-801誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)加快、刻板和共濟(jì)失調(diào)行為都低于對(duì)照組。其中對(duì)運(yùn)動(dòng)行為的影響下降了45％，影響達(dá)到了極顯著水平(P=0.007)；刻板行為方面也達(dá)到了顯著水平(P=0.046)。共濟(jì)失調(diào)的改善也比較顯著，達(dá)到顯著水平(P=0.026)。 (7)納米微粒載NF-κB圈套基因作用MK-801模型大鼠后NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-10在mRNA水平的表達(dá)發(fā)生了變化，NF-κB、IL-10表達(dá)上調(diào)，TNF-α、IL-1β、IL-2表達(dá)下調(diào)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均有顯著性差異。 結(jié)論： (1)乳化聚合法工藝可以制備粒徑較小、分布均勻的聚氰基丙烯酸正丁酯納米顆粒。經(jīng)陽(yáng)離子表面活性劑CTAB修飾，做為理想的納米基因載體，攜載NF-κB圈套DNA可以較高效能抑制NF-κB的活性； (2) MK-801誘導(dǎo)的精神分裂癥模型動(dòng)物存在NF-κB功能的亢進(jìn)和多種細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)的異常； (3)首次將納米微粒結(jié)合基因片段應(yīng)用于精神分裂癥的病理研究，初步結(jié)論認(rèn)為：納米NF-κB圈套DNA作用于精神分裂癥模型動(dòng)物可以干預(yù)NF-κB介導(dǎo)的免疫激活，為研究精神分裂癥與免疫系統(tǒng)的關(guān)系構(gòu)建了新的研究平臺(tái)； (4)應(yīng)用納米NF-κB圈套DNA作用于精神分裂癥模型動(dòng)物，可以部分逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的誘導(dǎo)癥狀，證實(shí)NF-κB與精神分裂癥模型動(dòng)物的行為存在關(guān)聯(lián)。
【圖文】：

博士學(xué)位論文第一部分聚氰基丙烯酸正丁醋納米粒制備工藝及作為基因載體的本研究中不同表面活性劑及組合均能制得平均粒徑在120一130nln的納(表l一3)，單用PluronieF一68平均粒徑最小為121.36士l.36nm，單用Dextra的跨度最小為0.38(圖1一l);添加TWeen-80會(huì)產(chǎn)生氣泡，電鏡觀察單用TWee制得的NP有粘連，單用Dextran70的表面更加平滑，反應(yīng)出現(xiàn)乳光即反應(yīng)的時(shí)間也較其它條件快。這是因?yàn)镈extran70是陰離子表面活性劑，能加快聚反應(yīng)的速度，微粒都帶負(fù)電荷，同性電荷增加了NP的穩(wěn)定性。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)用0.5%Dextran70作為單一表面活性劑優(yōu)化PBCA一NP制備條件�？梢�(jiàn)表面活劑對(duì)PBCA.NP有多方面影響。力忍啟月2刀力月42口今礴444，，33

PH值為0.5時(shí)PBCA.N甲粒徑最小;以膠體液出現(xiàn)乳光為準(zhǔn)，PH值小于2.0時(shí)聚合速度變慢，跨度變大，PH值為0.5時(shí)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)10h;PH值圖1一 3pH值為5.0的粒度分析圖，箭頭所指為大穎粒大于4.0聚合速度變快，平均粒徑增大，偶見(jiàn)soonln左右的大顆粒(圖1一3)。PH值5.0時(shí)制備的PBCA.NP在磁力轉(zhuǎn)子上形成團(tuán)塊，電鏡觀察有一定的粘連。這是由于PH太小時(shí)由于OH一太少、聚合反應(yīng)太慢，以致無(wú)法聚合成球，PH太高時(shí)OH.太多，聚合反應(yīng)太快。因此，在制備PBCA一NP時(shí)，嚴(yán)格控制介質(zhì)的pH值是關(guān)鍵。適宜的pH值下不僅能制得合適大小的NP，另一方面也可以通過(guò)改變pH值控制反應(yīng)速度和聚合程度。 1.3.1.3a-BCA用量對(duì)PBCA一NP制備的影響表1一4不同a一B以(%)用量對(duì)PBCA一NP粒徑和跨度的影響121.m士a咫1加刀士0.用*1刀腸士1.能*l艾67士0.田*1擬屯士0.所*跨度0320.350.30注:與濃度1嚼目比*尸<D.05
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R749.3

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本文編號(hào)：2656136