【摘要】：目的:探討復(fù)合菌種(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)益生菌的抗焦慮抑郁作用,分析其對腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成成分、血清和海馬炎癥因子,以及海馬吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1)的影響,從而探討益生菌潛在的抗焦慮抑郁機(jī)制。方法:1、實(shí)驗(yàn)動物分組:采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)連續(xù)4周構(gòu)建抑郁小鼠模型,益生菌選取的是復(fù)合菌種(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)凍干粉,以選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(Selective Serotonin Reuptake Inhibitor,SSRI)氟西汀為陽性對照藥物。6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為6組:慢性應(yīng)激+安慰劑組(CUMS+NS),慢性應(yīng)激+氟西汀組(CUMS+F),慢性應(yīng)激+益生菌組(CUMS+P),對照+安慰劑組(CON+NS),對照+氟西汀組(CON+F)和對照+益生菌組(CON+P)。通過灌胃的方式給予對應(yīng)的藥物。CUMS+P和CON+P每日給予益生菌2×10~9 CFU(0.2 mL),CUMS+F和CON+F每日給予氟西汀18 mg/kg,CUMS+NS和CON+NS組每日給予生理鹽水0.2 mL,慢性應(yīng)激組給藥的同時(shí)施加應(yīng)激程序,對照小鼠除了喂食、清潔籠子和給予對應(yīng)藥物外,不給予其他任何應(yīng)激。2、行為學(xué)測試:每周進(jìn)行小鼠體重的測定;4周造模及藥物干預(yù)結(jié)束后采用庶糖偏好實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),來評估小鼠焦慮抑郁樣行為的變化。3、腸道微生物菌群分析:盲腸內(nèi)容物利用16S rDNA測序,并進(jìn)行beta多樣性分析、alpha多樣性分析和物種豐度分析,來評估小鼠腸道微生物菌落結(jié)構(gòu)及組成的變化。4、炎癥因子指標(biāo):采用ELISA法測定血清和海馬組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白介素(interleukin,IL)-6、IL-10水平。5、海馬吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1)蛋白表達(dá):采用Western-Blotting法檢測海馬IDO1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1、4周CUMS誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著的焦慮抑郁樣行為。與對照組相比,CUMS小鼠體重增長顯著減慢(P0.05)。4周CUMS造模后小鼠蔗糖偏好指數(shù)顯著降低(P0.05),曠場實(shí)驗(yàn)中CUMS使小鼠在中心區(qū)域停留時(shí)間明顯減少(P0.05);高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中小鼠進(jìn)入開放臂停留時(shí)間顯著縮短(P0.05);強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的不動時(shí)間顯著增加(P0.05)。氟西汀干預(yù)可以完全逆轉(zhuǎn)這種慢性應(yīng)激引起的行為學(xué)變化,表現(xiàn)為:與CUMS+NS相比,CUMS+F組蔗糖偏好指數(shù)明顯升高(P0.05);曠場實(shí)驗(yàn)的中心區(qū)域停留時(shí)間顯著增加(P0.05);明顯縮短了高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的進(jìn)入開放臂停留時(shí)間(P0.05)以及強(qiáng)迫游泳時(shí)小鼠的不動時(shí)間(P0.05)。益生菌(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)部分逆轉(zhuǎn)了慢性應(yīng)激引起的行為學(xué)變化,表現(xiàn)為:與CUMS+NS相比,CUMS+P組曠場實(shí)驗(yàn)的中心區(qū)域停留時(shí)間顯著增加(P0.05);明顯縮短了高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的開放臂停留時(shí)間(P0.05)和強(qiáng)迫游泳時(shí)的不動時(shí)間(P0.05),益生菌干預(yù)雖對蔗糖偏好指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但有提高趨勢。2、從beta多樣性分析來看,CUMS使小鼠腸道菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。從alpha多樣性分析來看,CUMS造模后指數(shù)Chao1和Simpson顯著升高(P0.05),腸道菌群具有更高的多樣性和物種均勻性。另外分別在門、綱、目、科、屬分類等級進(jìn)行物種豐度的分析。結(jié)果顯示:48個樣品腸道微生物物種注釋主要?dú)w屬于4個門:分別是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和變形菌門(Proteobacteria),這4個菌門占到了總序列的(96.94±2.04%)。通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn):CUMS對小鼠腸道菌群中厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門和變形菌門的相對豐度無顯著影響。CUMS造模后,CUMS+NS與CON+NS相比,在綱水平,Bacilli相對豐度明顯減少(P0.05),而Erysipelotrichia和Betaproteobacteria相對豐度明顯增加(P0.05)。在目水平,Lactobacillales相對豐度明顯減少(P0.05),而Erysipelotrichales和Burkholderiales相對豐度明顯增加(P0.05);在科水平,Lactobacillaceae相對豐度明顯減少(P0.05),而Ruminococcaceae、Prevotellaceae、Erysipelotrichaceae、Rikenellaceae和Sutterellaceae相對豐度明顯增加(P0.05)。在屬水平,Lactobacillus,Barnesiella相對豐度明顯減少(P0.05),而Alloprevotella、Parasutterella及Parabacteroides相對豐度顯著增加(P0.05)。補(bǔ)充益生菌后Bacilli綱,Lactobacillales目,Lactobacillaceae科,Lactobacillus屬相對豐度明顯增加(P0.05),而Prevotellaceae科,Alloprevotella和Parabacteroides屬的相對豐度顯著減少(P0.05)。3、炎癥細(xì)胞因子測定結(jié)果顯示,CUMS造模后,血清TNF-α水平以及海馬IFN-γ,TNF-α水平顯著升高(P0.05),且CUMS同時(shí)補(bǔ)充氟西汀或益生菌后,均可以使血清TNF-α和海馬IFN-γ、TNF-α表達(dá)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、Western Blotting結(jié)果顯示CUMS+NS組小鼠海馬中IDO1蛋白水平明顯高于CON+NS組(P0.05)。補(bǔ)充益生菌或氟西汀可以顯著降低海馬中的IDO1蛋白水平(P0.05)。結(jié)論:CUMS小鼠的腸道菌群落結(jié)構(gòu)和組成,外周血促炎細(xì)胞因子以及中樞海馬促炎細(xì)胞因子和IDO1蛋白水平發(fā)生了明顯的變化。復(fù)合菌種益生菌(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)通過對腸道微生態(tài)失調(diào)的調(diào)整作用,抑制外周血TNF-α水平及海馬IFN-γ、TNF-α水平,直接或炎癥因子介導(dǎo)的抑制海馬IDO1表達(dá),具有改善CUMS誘導(dǎo)焦慮和抑郁樣行為的作用。腸道微生物-炎癥-腦軸可能是復(fù)合菌種益生菌(Lactobacillus helveticus R0052+Lactobacillus plantarum R1012+Bifidobacterium longum R0175)抗焦慮抑郁效應(yīng)的潛在作用機(jī)制。
【圖文】：

圖 1. 建立慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型時(shí)的刺激程序安排 動物分組及基本流程用隨機(jī)數(shù)字表分組法進(jìn)行分組，分為 6 組，每組 8 只，分別為：慢性應(yīng)組（CUMS+NS），慢性應(yīng)激+氟西汀組（CUMS+F），慢性應(yīng)激+益生UMS+P），對照+安慰劑組（CON+NS），對照+氟西汀組（CON+F）和菌組（CON+P）。所有慢性應(yīng)激組每日按圖 1 施予應(yīng)激程序，并灌胃給予預(yù)藥物。對照三組除添加飼料和水，清潔鼠籠，灌胃對應(yīng)的藥物外，不施激刺激。28 d 后，所有小鼠均進(jìn)行了連續(xù) 4 d 的行為學(xué)測試，之后處死，（圖 2）。 實(shí)驗(yàn)藥品益生菌選用的是復(fù)合菌種凍干粉（Lactobacillus helveticus R0052+Lactobatarum R1012+Bifidobacterium longum R0175）(加拿大拉曼公司) 每日用生

圖 2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。CUMS：慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激；SPT：庶糖偏好實(shí)驗(yàn)；OFT：曠場實(shí)驗(yàn)；EPM：高架十字迷宮；FST：強(qiáng)迫游泳；CUMS+NS：慢性應(yīng)激同時(shí)給予生理鹽水；CUMS+F：慢性應(yīng)激同時(shí)給予氟西汀干預(yù)；CUMS+P：慢性應(yīng)激同時(shí)給予益生菌干預(yù)； CON+NS：對照僅給予生理鹽水；CON+F：對照給予氟西汀干預(yù)；CON+P：對照給予益生菌干預(yù)。2.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)2.4.1 庶糖偏好實(shí)驗(yàn)（sucrose preference test，SPT）SPT 是用來評價(jià)嚙齒類動物快感缺失的指標(biāo)，快感缺失作為抑郁癥的核心癥狀。SPT 一共進(jìn)行兩次：第一次，在實(shí)驗(yàn)開始前，作為基線，也作為訓(xùn)練測試；第二次，在 CUMS 4 周后（第 29 d），作為行為學(xué)測試的一部分。進(jìn)行 SPT 時(shí)所有小鼠均單獨(dú)飼養(yǎng)，并給予事先稱重的兩個水瓶，，分別裝 1%（w/v）蔗糖溶液或自來水。每隔12 h 更換一次水瓶位置，以防止水瓶位置對實(shí)驗(yàn)的干擾。24 h 后，取走兩個水瓶，通過稱重水瓶，計(jì)算出小鼠的蔗糖消耗量、自來水消耗量[69]。蔗糖偏好指數(shù)%=蔗
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749

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本文編號：2653820