【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD),俗稱老年癡呆癥,是一種較常見的神經(jīng)退行性疾病,老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡是其三大病理學(xué)特征。越來越的證據(jù)表明：β-淀粉樣肽(p-amyloid peptide, Aβ42)的大量產(chǎn)生和聚集是導(dǎo)致AD發(fā)生、發(fā)展的根本原因。大量的研究證明,Aβ42寡聚體是最具神經(jīng)細(xì)胞毒性的形式。Aβ42在體內(nèi)由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶順次剪切產(chǎn)生的,即β-分泌酶剪切APP產(chǎn)生C99,γ-分泌酶再剪切C99產(chǎn)生Aβ42。本論文分別針對(duì)Aβ42寡聚體的細(xì)胞毒性和針對(duì)γ-分泌酶的催化組分PS1與C99相互作用兩個(gè)重要環(huán)節(jié)對(duì)抗Aβ42的抗體和天然藥物組分進(jìn)行了研究。 一、針對(duì)Aβ42寡聚體靶點(diǎn)的抗Aβ42抗體的效應(yīng)分析 一直以來困擾AD免疫治療的主要問題是疫苗或抗體的安全性。在前期研究中,我們?cè)O(shè)計(jì)合成了多種Aβ42相關(guān)抗原蛋白,并獲得了相應(yīng)的抗Aβ42的系列抗體,其中抗原GST-I-Ap28和GST-Ap42誘導(dǎo)了最強(qiáng)的抗Aβ42的免疫反應(yīng),抗體滴度達(dá)到1：3200,這兩種抗體在抑制和中和Aβ42細(xì)胞毒性方面也顯示了最強(qiáng)的功效,并且透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)它們能夠有效抑制、逆轉(zhuǎn)Aβ42的纖維化。在本論文中：(1)分析了抗原GST-I-Ap28, GST-Ap42誘導(dǎo)的抗Aβ42抗體的亞型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GST-I-Aβ28誘導(dǎo)的抗體主要為IgG1和IgG2b亞型,而GST-Aβ42誘導(dǎo)的抗體則主要為IgG2b和IgG2a亞型,這表明GST-I-Ap28主要誘導(dǎo)產(chǎn)生了Th2類免疫反應(yīng),而GST-Aβ42則主要誘導(dǎo)產(chǎn)生了Th1類免疫反應(yīng)。上述結(jié)果表明了GST-I-Ap28作為免疫原的安全性。(2)分析了上述兩種抗體對(duì)Aβ42不同聚集形式的識(shí)別特異性,結(jié)果顯示：兩者對(duì)Aβ42單體和Aβ42寡聚體的識(shí)別能力均高于對(duì)Aβ42原纖維和Aβ42纖維的識(shí)別。上述結(jié)果表明了GST-I-Ap28誘導(dǎo)抗體識(shí)別Aβ42寡聚體的有效性。(3)分析了上述兩種抗體對(duì)轉(zhuǎn)染了APP的靶細(xì)胞在Aβ42寡聚體基質(zhì)上粘附的影響,結(jié)果顯示：兩種抗體均能有效抑制靶細(xì)胞在Aβ42基質(zhì)上的粘附。 最近有研究結(jié)果顯示：Aβ42寡聚體可能是通過與細(xì)胞表面APP分子的相互作用,加速APP二聚化,導(dǎo)致APP的胞內(nèi)區(qū)段被caspase 8水解產(chǎn)生具有潛在毒性的C31片段,引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果顯示：本論文分析的抗體可能是通過與Aβ42以及Aβ42的前體蛋白(如APP.C99)分子中的Aβ42區(qū)結(jié)合,從而阻礙了Aβ42與APP的相互作用,抑制了APP介導(dǎo)的Aβ42毒性通路。 二、針對(duì)Aβ42寡聚體靶點(diǎn)的天然藥物效應(yīng)分析 天然藥物在AD治療的研究中日益被重視。本論文選擇了20種傳統(tǒng)中藥人參、枸杞、銀杏、川芎、刺五加、五味子、母菊、丹參、蒲公英、丹皮、桃仁、紅花、三七、生地、熟地、馬齒莧、丹皮、赤芍、黃芪、遠(yuǎn)志、茯苓作為目標(biāo)中藥,提取了天然藥物組分,針對(duì)Aβ42靶點(diǎn),以PC12細(xì)胞為靶細(xì)胞,對(duì)這些天然藥物的效應(yīng)進(jìn)行了分析：(1)通過MTT法檢測(cè)這20種天然藥物提取物對(duì)Aβ42細(xì)胞毒性的抑制和中和作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：銀杏、枸杞、母菊、遠(yuǎn)志等四種天然藥物的提取物的作用顯著。進(jìn)一步研究確定了銀杏黃酮、枸杞多糖、母菊內(nèi)酯、母菊黃酮、遠(yuǎn)志皂甙等5種先導(dǎo)化合物為有效的天然藥物成分,其中母菊內(nèi)酯、母菊黃酮在抑制和中和Aβ42細(xì)胞毒性方面的作用最強(qiáng)。(2)通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：母菊內(nèi)酯、母菊黃酮具有抑制、逆轉(zhuǎn)Aβ纖維化的作用。(3)分析了母菊內(nèi)酯、母菊黃酮對(duì)轉(zhuǎn)染了APP的靶細(xì)胞在Aβ42寡聚體基質(zhì)上粘附的影響,結(jié)果顯示：兩者均能有效抑制靶細(xì)胞在Aβ42基質(zhì)上的粘附。(4)進(jìn)一步通過細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)分析了母菊黃酮、母菊內(nèi)酯對(duì)轉(zhuǎn)染了γ-分泌酶催化組分PS1及其N-、C-片段(PSl-F、PSl-N、PSl-C)的COS-7細(xì)胞在C99基質(zhì)上的粘附的影響,并通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析了母菊黃酮、母菊內(nèi)酯對(duì)PS1和C99相互作用的影響。上述分析均以PS1的另一種重要底物NOTCH△E (Notch的β-分泌酶剪切產(chǎn)物)為對(duì)照。研究結(jié)果顯示：母菊黃酮、母菊內(nèi)酯抑制了轉(zhuǎn)染了PS1的靶細(xì)胞COS-7在C99基質(zhì)上的粘附,同時(shí)也抑制了PS1與C99的相互作用,但對(duì)PS1與NOTCH△E的相互作用無明顯影響。 綜上所述,由于母菊黃酮、母菊內(nèi)酯表現(xiàn)出的一系列與抗Aβ42抗體類似的功效,推測(cè)它們可能是通過與C99分子中的Aβ42區(qū)域特異性結(jié)合,從而特異性抑制PS1和C99的相互作用。上述結(jié)果表明母菊內(nèi)酯、母菊黃酮在針對(duì)Aβ42寡聚體的細(xì)胞毒性和針對(duì)PS1與C99相互作用兩個(gè)重要環(huán)節(jié)上均具有顯著的功效。 本論文的研究結(jié)果為防治AD的抗體或天然藥物的應(yīng)用研究和藥物制備提供了理論指導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2650284