【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種與年齡高度相關(guān)、進(jìn)行性發(fā)展的原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病。盡管AD的發(fā)病機(jī)制至今不明,但眾多研究表明,β-淀粉樣蛋白(Amyloidβ-protein, Aβ)是各種原因誘發(fā)AD的共同通路,是AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此,圍繞Aβ展開的對AD發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的各種影響因素及其調(diào)節(jié)機(jī)制的探討是當(dāng)今該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。 近年來,環(huán)境中低劑量鉛(Lead, Pb)暴露對人群健康的影響已成為重要的公共衛(wèi)生問題。發(fā)育期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)對鉛的毒性尤為敏感,可導(dǎo)致兒童智力損害以及認(rèn)知和注意力等神經(jīng)功能障礙,而個體認(rèn)知功能下降與AD的病理改變存在一定的相關(guān)性�；诔扇思膊〉呐咛テ鹪醇僬f,有學(xué)者提出AD存在早期起源的可能性,結(jié)合鉛在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中不可忽視的毒性效應(yīng),本研究認(rèn)為鉛可能參與了個體AD樣變進(jìn)程。 表觀遺傳(Epigenetics)是針對基因與環(huán)境相互作用所致基因表達(dá)變化的一個重要的適應(yīng)機(jī)制。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AD是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜的異質(zhì)性疾病,已有證據(jù)提示表觀遺傳修飾異�？赡苁沁t發(fā)型AD發(fā)病的重要機(jī)制之一,因此本研究認(rèn)為環(huán)境鉛可能通過對表觀遺傳修飾的影響在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 為驗(yàn)證上述假設(shè),本研究運(yùn)用食蟹猴隊列研究并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn),探討鉛在AD樣變進(jìn)程中的作用及可能的表觀遺傳修飾效應(yīng),從而為進(jìn)行AD的病因及發(fā)病機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。 目的 1基于發(fā)育早期鉛暴露食蟹猴模型,探討鉛暴露、表觀遺傳修飾在AD樣進(jìn)程中可能致病機(jī)制。 2通過構(gòu)建鉛暴露體外模型,探討鉛對SH-SY5Y細(xì)胞可能的AD樣作用。評估鉛暴露對SH-SY5Y細(xì)胞組蛋白乙�；凹谆揎椀挠绊憽� 材料與方法 1研究對象 1.1動物模型：將剛出生的10只雌性食蟹猴隨機(jī)分為兩組進(jìn)行隊列研究。鉛暴露組(23PbE)：從幼猴出生之日至400日齡每天飲用含醋酸鉛的配方奶粉,劑量為1.5 mg·kg-1·d-1。對照組(23CT)：從幼猴出生之日至400日齡每天飲用無鉛配方奶粉。兩組動物斷乳后常規(guī)無鉛飲食飼養(yǎng)至23歲,分批次實(shí)施安樂死。另選擇雌性食蟹猴8只,從出生之日至400日齡每天給予無鉛配方奶粉飲食,自401日齡起斷乳并開始常規(guī)無鉛飲食飼養(yǎng),于各取樣節(jié)點(diǎn)(3～6歲或12歲)分批次對實(shí)驗(yàn)動物實(shí)施安樂死。分離雙側(cè)大腦皮層備用。 1.2細(xì)胞株：選用人源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞株作為研究對象。經(jīng)RA分化后,分別給予終濃度為5μM～100μM的醋酸鉛染毒。 2方法 2.1采用Western blot及免疫熒光分析技術(shù)檢測各實(shí)驗(yàn)組AD相關(guān)蛋白、DNA甲基化修飾、組蛋白乙酰化及甲基化修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過微陣列分析技術(shù)檢測神經(jīng)生物相關(guān)基因的表達(dá)譜。 2.2采用實(shí)時定量PCR分析AβPP、NEP基因mRNA的表達(dá),采用ELISA方法檢測醋酸鉛暴露對Aβ1-40表達(dá)的影響,并對NEP活性進(jìn)行熒光測定。 3統(tǒng)計分析 使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析；兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。兩組樣本間相關(guān)性比較采用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。 結(jié)果 1年齡及發(fā)育早期鉛暴露對食蟹猴AD相關(guān)蛋白、DNMT1、DNMT3a及MeCP2表達(dá)的影響 隨著年齡的增長,食蟹猴皮層組織中AβPP蛋白水平逐漸升高。正常23歲齡組的表達(dá)高于3-6歲齡組及12歲齡組(P0.01)。23PbE組AβPP蛋白表達(dá)水平高于23CT組(P0.05)。隨著年齡的增長,食蟹猴大腦皮層組織中NEP蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。正常12歲年齡組NEP蛋白的表達(dá)明顯高于3-6歲齡組及23歲齡組(P0.01)。此外,23PbE組NEP蛋白表達(dá)水平低于23CT組(P0.01)。 隨著年齡的增長,食蟹猴皮層組織中DNMT1蛋白的表達(dá)逐漸下降。正常23歲齡組低于3-6歲齡組及12歲齡組(P0.01)。此外,23PbE組DNMT1蛋白表達(dá)水平也低于23CT組。各組DNMT3a及MeCP2與DNMT1蛋白表達(dá)趨勢一致(P0.05)。 2發(fā)育早期鉛暴露對食蟹猴神經(jīng)生物相關(guān)基因表達(dá)的影響 在篩檢的588個與神經(jīng)生物學(xué)相關(guān)基因中,發(fā)現(xiàn)16個基因的表達(dá)明顯低于對照組,僅6個基因在鉛暴露組的表達(dá)明顯高于對照組。其中20個基因的啟動子區(qū)域富含CpG。 3年齡及發(fā)育早期鉛暴露對食蟹猴組蛋白修飾水平的影響 HDAC活性在正常23歲齡組食蟹猴皮層組織中的表達(dá)低于3-6歲齡組及12歲齡組(P0.05)。與23CT組比較,23PbE組HDAC活性明顯升高(P0.01)。而特異性位點(diǎn)H3K9ac、H4K12ac蛋白水平在正常23歲齡組食蟹猴皮層組織中的表達(dá)均明顯高于3～6歲齡組及12歲齡組(P0.01)。23PbE組上述組蛋白位點(diǎn)乙�；矫黠@低于23CT組(P0.01)。 正常23歲齡組G9a蛋白的表達(dá)明顯高于3～6歲齡組及12歲齡組。23PbE組G9a蛋白表達(dá)水平高于23CT組(P0.05)。各組特異性位點(diǎn)H3K9me2、H3K27me2蛋白表達(dá)水平與之一致。 4醋酸鉛對SH-SY5Y細(xì)胞AβPP、NEP及Aβ1-40表達(dá)的影響 不同濃度醋酸鉛暴露48 h后,SH-SY5Y細(xì)胞AβPP表達(dá)增加,并存在濃度依賴性。NEP蛋白在20gM～100gM醋酸鉛暴露組(PbE)細(xì)胞中的表達(dá)低于對照組(P0.01)。10μM～100μM PbE組細(xì)胞AβPP mRNA的表達(dá)均高于對照組(P0.01)。5μM及10μM PbE組細(xì)胞NEP mRNA的表達(dá)低于對照組(P0.01)。細(xì)胞經(jīng)低濃度鉛暴露(10μM)后,其NEP活性的下調(diào)發(fā)生于鉛暴露48 h(P0.01)。與對照組比較,5μM及10μM PbE組細(xì)胞NEP的活性水平均降低(P0.01)。 隨著醋酸鉛濃度的升高,細(xì)胞培養(yǎng)液中Ap1-40的表達(dá)逐漸升高(P0.01)。細(xì)胞培養(yǎng)液中Aβ1-40含量與AβPP mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P0.01),而與NEP蛋白及活性水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P0.05)。 5醋酸鉛對SH-SY5Y細(xì)胞組蛋白修飾的影響 與對照組比較,50μM及100gM醋酸鉛暴露可抑制SH-SY5Y細(xì)胞H3K9ac、H4K12ac位點(diǎn)組蛋白的表達(dá)(P0.01)。經(jīng)100μM鉛暴露48 h,整體HDAC的活性水平明顯升高(P0.01)。鉛暴露24 h時給予細(xì)胞10μM VPA干預(yù),可顯著下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞的HDAC活性及Aβ1.40的表達(dá)(P0.01)。 與對照組比較,100μM PbE組H3K9me2位點(diǎn)甲基化表達(dá)明顯增加,同時50μM及100μM PbE組H3K27me2位點(diǎn)甲基化表達(dá)明顯增加(P0.01)。與對照組比較,100μM PbE組G9a蛋白的表達(dá)明顯增加(P0.01),細(xì)胞內(nèi)G9a的定位表達(dá)結(jié)果與之一致。 結(jié)論 1年齡是食蟹猴AD相關(guān)蛋白表達(dá)及表觀遺傳修飾調(diào)控的重要影響因素。 2發(fā)育早期鉛暴露對食蟹猴AD相關(guān)蛋白表達(dá)的影響具有遲發(fā)效應(yīng),表觀遺傳修飾可能參與這一過程。 3在鉛暴露致SH-SY5Y細(xì)胞AD樣作用的過程中,組蛋白乙�；揎梾⑴cAp表達(dá)的調(diào)控。
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表2.1蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作0.2mg/m編號蛋白含量(林g/林l)BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液(林l)5Zmg/mlBSA標(biāo)準(zhǔn)溶液去離子水(閃)BCA工作液(林l)ofl，

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