【摘要】：目的:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年癡呆中最常見的一種類型,是一種以記憶障礙、認(rèn)知障礙、執(zhí)行功能障礙等為主要表現(xiàn)的漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病。主要病理表現(xiàn)為淀粉樣蛋白(amyloid beta,Aβ)沉積,微管相關(guān)tau蛋白磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)、突觸功能受損,神經(jīng)元丟失和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。針對(duì)AD發(fā)病的原因尚未明確,其中“淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說”目前受到廣泛的認(rèn)可。假說認(rèn)為淀粉樣蛋白沉積是AD的起病和發(fā)展中的中心環(huán)節(jié),AD患者機(jī)體本身對(duì)淀粉樣蛋白的清除和蛋白產(chǎn)生之間的失衡誘導(dǎo)了淀粉樣蛋白的沉積,繼而引起突觸損傷、tau蛋白磷酸化、神經(jīng)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元壞死等特征性的病理變化。起初人們一直把研究的重點(diǎn)聚焦到清除淀粉樣斑塊上,然而隨著研究的不斷深入,許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證實(shí)了清除淀粉樣蛋白斑塊并不能很好的改善阿爾茨海默病相關(guān)的病理改變。因此,Aβ寡聚體逐漸成為了新的研究熱點(diǎn)。在“淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說”的基礎(chǔ)上,有人提出了“淀粉樣蛋白寡聚體級(jí)聯(lián)假說”。清除已經(jīng)形成的淀粉樣斑塊并不是治療疾病的首要目的,預(yù)防淀粉樣蛋白沉積具有更大的意義。目前臨床上對(duì)阿爾茨海默病的治療仍舊以控制疾病進(jìn)展為主,以Aβ為靶點(diǎn)的主動(dòng)和被動(dòng)免疫治療是基礎(chǔ)試驗(yàn)中研究的主要方向。一些在動(dòng)物模型上進(jìn)行的Aβ相關(guān)疫苗試驗(yàn)取得了一定的效果,在接受免疫治療后,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的Aβ沉積減少,突觸損傷和神經(jīng)炎癥反應(yīng)得到了改善,并且認(rèn)知學(xué)習(xí)功能也有所提高�？茖W(xué)家們將一些疫苗開展到臨床試驗(yàn)中,但是大多數(shù)在前期就以失敗告終。在針對(duì)AD的研究過程中,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的成功建立發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。AD病理改變十分復(fù)雜,因此建立能夠全面表達(dá)AD所有病理改變的動(dòng)物模型具有很大的難度。最初人們使用較多為APP或tau單轉(zhuǎn)基因和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型。直至2003年Oddo等人成功建立了APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠,使得研究Aβ與tau蛋白的相互作用關(guān)系得以實(shí)現(xiàn)。這個(gè)三轉(zhuǎn)基因小鼠也是直到目前為止,與AD病理改變最相近的動(dòng)物模型。小鼠表現(xiàn)為與年齡相關(guān)的病理變化,首先可以在腦組織中檢測(cè)到Aβ產(chǎn)生,隨著時(shí)間的增加,可以逐漸檢測(cè)到突觸受損、炎癥細(xì)胞增多以及tau蛋白磷酸化的改變。突觸可塑性異常和神經(jīng)炎癥反應(yīng)都能引起認(rèn)知功能的損傷,而這兩種病理改變也是由上游的可溶性Aβ寡聚體所導(dǎo)致的。因此,通過早期的主動(dòng)免疫治療,有效的預(yù)防Aβ產(chǎn)生和清除Aβ成為本次的研究重點(diǎn)。同時(shí)在清除Aβ的基礎(chǔ)上檢測(cè)下游的突觸損傷、tau蛋白和神經(jīng)炎癥反應(yīng)的改善情況。研究方法:將合成的多肽疫苗Aβ3-10與血藍(lán)蛋白KLH偶聯(lián),采用皮下注射的方式免疫三轉(zhuǎn)基因(APP/PS1/tau)AD模型小鼠,從小鼠1月齡起開始注射,共進(jìn)行7次免疫。另外一組小鼠以相同方式注射等量的PBS作為陰性對(duì)照。在第一次免疫前和每次免疫后通過小鼠內(nèi)眥靜脈采集一定量的血液,離心后取上層血清采用ELISA的方法檢測(cè)Aβ抗體的濃度。在小鼠完成末次免疫后,經(jīng)心臟生理鹽水灌流取出腦組織,右腦用于制備腦勻漿ELISA法檢測(cè)腦組織中可溶性和不可溶性Aβ蛋白以及tau蛋白的含量,并采用Western blot方法檢測(cè)腦組織中Aβ寡聚體含量和突觸相關(guān)蛋白的含量變化。左側(cè)腦組織用4%多聚甲醛固定后通過免疫組化染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外Aβ蛋白和與炎癥反應(yīng)相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度,并與相同月齡的野生型背景小鼠相互比較。結(jié)果:隨著免疫次數(shù)的增加,小鼠血清中抗體的濃度也逐漸升高,在Aβ3-10-KLH進(jìn)行七次免疫后,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了較高濃度的抗Aβ抗體。而沒有接受免疫的小鼠雖然也有抗體產(chǎn)生,但維持在極低的水平。免疫后小鼠腦組織中可溶性和不可溶性的Aβ的含量均明顯降低,tau蛋白含量也明顯減少,Aβ寡聚體在Western blot檢測(cè)里也表現(xiàn)為減少的趨勢(shì)。通過Western blot檢測(cè)突觸前后膜相關(guān)的標(biāo)記蛋白,未接受免疫治療的小鼠腦組織中突觸素、發(fā)動(dòng)蛋白1、PSD-95以及NR2B受體的含量與野生型小鼠相比均有明顯的下降,而免疫后的小鼠四種蛋白的含量均有所提升。免疫組化結(jié)果顯示:免疫后小鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)外的Aβ含量都低于陰性對(duì)照組的轉(zhuǎn)基因小鼠。PBS注射的小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度明顯高于野生型小鼠,而免疫后的小鼠腦組織中的活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞則明顯少于PBS組小鼠。結(jié)論:1、在三轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)AD相關(guān)病理改變之前使用新型的Aβ多肽疫苗Aβ3-10-KLH對(duì)其進(jìn)行免疫治療,末次免疫后血清中產(chǎn)生了較高濃度的Aβ抗體。2、疫苗產(chǎn)生的抗體不僅能夠減少與Aβ寡聚體相關(guān)的可溶性淀粉樣蛋白,也能減少形成沉積斑塊的不可溶性的淀粉樣蛋白,和tau蛋白在腦組織中的含量。3、疫苗減少了APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)外Aβ蛋白的含量。4、疫苗對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織的突觸產(chǎn)生了有效的保護(hù)作用。5、疫苗減少了小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,從而減輕了炎癥反應(yīng)的程度。6、我們使用Aβ多肽疫苗進(jìn)行主動(dòng)免疫治療不僅減少了Aβ相關(guān)的病理改變,也改善了由Aβ繼發(fā)的與AD關(guān)系密切的tau蛋白、突觸及神經(jīng)炎癥的病理改變,為“淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說”的成立提供了依據(jù)。
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，免疫前小鼠血清中抗體的含量幾乎為零；在第二次免疫Aβ3-10-KLH 組小鼠血清中的抗體濃度開始產(chǎn)生明顯的升高，并隨著免疫次數(shù)增加而逐漸升高；而 PBS 組小鼠雖然也檢測(cè)到自身產(chǎn)生了一定量的抗體，但一直維持在一個(gè)很低的濃度 在第七次免疫后，Aβ3-10-KLH 組小鼠血清中的體濃度為 44.77±41.91 μg/mL，而 PBS 組抗體的濃度僅為 2.21±0.89 μg/mL，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.01）（圖 1） 末次免疫后，Aβ3-10-KLH 組小鼠清中的抗體濃度具有較大的個(gè)體差異，其中最高值為 118.808 μg/mL，最低值16.45 μg/mL（圖 2）

圖 2Aβ3-10-KLH 組每只小鼠最后一次免疫后血清中抗體的濃度早期 Aβ3-10-KLH 免疫治療減少 APP/PS1/tau 三轉(zhuǎn)基因小鼠的 Aβ1-x 含量淀粉樣蛋白的出現(xiàn)是阿爾茨海默病的一種主要的病理特征，尤其是可溶疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用 三轉(zhuǎn)基因小鼠最早可于 2 月齡時(shí)檢測(cè)蛋白的陽(yáng)性反應(yīng) 在完成第七次免疫后處死小鼠并取出腦組織制備腦 ELISA 檢測(cè)腦勻漿中可溶性和不可溶性 Aβ1-x（包括 Aβ1-42，Aβ1-40蛋白的含量，并將 Aβ3-10-KLH 組與 PBS 組的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯-10-KLH 免疫治療不僅減少了可以產(chǎn)生毒性作用的可溶性的 Aβ1-x 的少了組成細(xì)胞外斑塊沉淀的不可溶性的 Aβ1-x（圖 3） 其中可溶性的 40.24%，，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05）；不可溶性的 Aβ 減少了 64.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2641902