發(fā)布時(shí)間：2020-04-26 19:17

【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種多發(fā)于老年人的以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。其病理學(xué)特征為腦內(nèi)細(xì)胞外淀粉樣蛋白(amyloid peptides, Aβ)斑塊沉積、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neural fibrillary tangles,NFTs)以及神經(jīng)元丟失。AD的病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,占主導(dǎo)地位的Aβ學(xué)說(shuō)[2]認(rèn)為β-淀粉樣蛋白前體(APP)裂解產(chǎn)生的Aβ是AD患者腦內(nèi)老年斑(SP)的主要成分,它引發(fā)AD的病理改變,導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)形成、神經(jīng)細(xì)胞丟失、血管損傷和癡呆形成。目前AD的治療仍以藥物為主,包括作用于膽堿能系統(tǒng)的藥物、抗氧化藥物、抑制Aβ形成和聚集的藥物、抗炎藥物、5-HT受體拮抗藥、鉀通道阻滯劑、腦代謝激活劑及中藥等[3]。由于這些藥物的治療作用主要集中在維持退化的膽堿能神經(jīng)元功能及疾病的早期,對(duì)于神經(jīng)元大量丟失的晚期A(yíng)D患者沒(méi)有治療效果。尋找能夠改善AD患者中、晚期癥狀和細(xì)胞丟失的治療方法已迫在眉睫。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)移植為AD的治療帶來(lái)了希望。 神經(jīng)干細(xì)胞具有自我增殖和神經(jīng)分化的生物學(xué)特性,可以分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞。通過(guò)移植外源性NSCs可望補(bǔ)充替代因疾病或損傷而丟失的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[4]。這種神經(jīng)替代策略已在帕金森病[5,6]、亨廷頓病[7]、卒中[8]、脊髓損傷[9]等領(lǐng)域取得了令人鼓舞的成績(jī),部分成果已成功運(yùn)用于臨床。文獻(xiàn)報(bào)道,將人NSCs移植到24月齡大鼠的腦內(nèi),能有效改善老齡鼠的認(rèn)知功能障礙[10]。Wang等將胚胎干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)球移植到AD小鼠的前額葉和頂葉皮層,移植的神經(jīng)球能存活、遷移并分化為膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶陽(yáng)性神經(jīng)元和少數(shù)5-羥色胺能神經(jīng)元,并顯著改善AD小鼠的工作記憶能力[11]。神經(jīng)干細(xì)胞移植成功的關(guān)鍵在于植入的神經(jīng)元能整合到受者神經(jīng)環(huán)路中去,即與受者神經(jīng)元之間形成有功能的突觸聯(lián)系[12]。雖然有大量的研究表明細(xì)胞替代治療能改善動(dòng)物模型的認(rèn)知能力,但是對(duì)于移植細(xì)胞與受者神經(jīng)環(huán)路功能性整合這一重要問(wèn)題缺乏證據(jù)支持。為此,我們將胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)無(wú)血清誘導(dǎo)為神經(jīng)前體細(xì)胞(Neural precursor cells,NPCs)后移植到Aβ1-40損傷大鼠海馬齒回,觀(guān)察移植細(xì)胞的遷移、分化、與受者神經(jīng)系統(tǒng)的整合以及對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善情況,為AD的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法 1.本研究采用海馬齒回定位注射老化態(tài)Aβ1-40的方法建立AD大鼠模型,并對(duì)該模型進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試和包括剛果紅染色、Fluoro-Jade B染色、尼氏染色以及GFAP免疫組化等組織病理學(xué)鑒定。 2.從E13.5胎鼠原代分離小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,傳代培養(yǎng)并經(jīng)絲裂霉素C處理后作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。小鼠胚胎干細(xì)胞體外擴(kuò)增后經(jīng)改良的無(wú)血清培養(yǎng)法誘導(dǎo)分化產(chǎn)生神經(jīng)前體細(xì)胞,并對(duì)其行Nestin免疫熒光染色鑒定和分化潛能的鑒定。 3.將無(wú)血清誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞定點(diǎn)移植到Aβ1-40損傷的大鼠海馬齒回,觀(guān)察移植細(xì)胞的存活、遷移、分化、整合以及細(xì)胞移植對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的改善情況。 結(jié)果 1.通過(guò)海馬內(nèi)注射老化態(tài)Aβ1-40多肽成功建立AD大鼠模型。該模型空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損。在注射區(qū)可檢測(cè)到剛果紅染色陽(yáng)性斑塊。顆粒細(xì)胞層背側(cè)帶及齒回神經(jīng)元大量變性壞死、丟失,損傷區(qū)有長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月之久的膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。因此該模型能較好的模擬AD的行為學(xué)和病理學(xué)特征,損傷部位明確,制作簡(jiǎn)單,有利于進(jìn)行AD的基礎(chǔ)和細(xì)胞移植研究。 2.以經(jīng)絲裂霉素C預(yù)處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,結(jié)合1000IU/ml的LIF,能有效地維持ESCs的增殖能力和未分化狀態(tài)。采用改良的無(wú)血清選擇性誘導(dǎo)法,依次經(jīng)歷ESCs—EBs—NPCs等幾個(gè)階段,可獲得大量高純度的神經(jīng)前體細(xì)胞。 3. NPCs海馬內(nèi)移植能顯著改善Aβ?lián)p傷大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。 4. NPCs移植Aβ?lián)p傷大鼠海馬齒回后向顆粒細(xì)胞層兩側(cè)發(fā)生遷移。移植細(xì)胞在體存活率較低,且隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞存活率逐漸降低。存活的NPCs以星型膠質(zhì)細(xì)胞分化為主,少數(shù)分化為T(mén)uj1陽(yáng)性神經(jīng)元。 5.少數(shù)植入Aβ?lián)p傷大鼠海馬齒回的NPCs能分化為谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神經(jīng)元,表達(dá)NMDA受體、AMPA受體和GABAA受體,并且在其胞膜上觀(guān)察到PSD95的表達(dá)以及受者神經(jīng)元來(lái)源的突觸素陽(yáng)性顆粒。部分分化神經(jīng)元能與受者自身神經(jīng)元形成突觸并整合到受者神經(jīng)環(huán)路中去,參與大鼠的學(xué)習(xí)記憶過(guò)程。
【圖文】：

圖 1-1 右側(cè)海馬齒回立體定位注射凝聚態(tài) Aβ1-40）Morris 水迷宮檢測(cè) AD 模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力宮由一個(gè)直徑為 130cm，，高 50cm 的圓形水池組成。池內(nèi)水深 30cm 1℃，室內(nèi)溫度保持在 25℃左右。用熱水將奶粉沖泡均勻，加水使水平臺(tái)面 2cm。池壁上標(biāo)有東南西北四個(gè)入水點(diǎn)，它們將水池等分為四W、NW、SW、NE 象限，在 NE 象限正中離池壁 25cm 處放一個(gè)直徑 的圓形透明平臺(tái)。迷宮正上方懸掛攝像機(jī)，并連接錄像機(jī)、監(jiān)視器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。迷宮外有許多參照物(如門(mén)、窗、冰箱、電燈)保持環(huán)境安靜。訓(xùn)練程序包括:定位航行試驗(yàn)(place navigation test)測(cè)試大鼠對(duì)水迷官學(xué)習(xí)與記憶的獲取能力。實(shí)驗(yàn)歷時(shí) 5 天，開(kāi)始前泳 2 分鐘進(jìn)行習(xí)服訓(xùn)練，使其熟悉水溫與實(shí)驗(yàn)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每（block），每段訓(xùn)練 4 次(trial)，訓(xùn)練時(shí)操作者隨機(jī)選擇一個(gè)象限為

圖 1-3 大鼠游泳軌跡示意圖定位航行試驗(yàn)驗(yàn)（第 9 段第 4 次測(cè)試）：A:NS 組；B：Aβ1-40組；空間探索試驗(yàn)：C:NS 組；D：Aβ1-40組*020406080NS Aβ1-40*02468101214NS Aβ1-40Timesfocrsosignthelptafomrposition
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 徐強(qiáng);徐如祥;姜曉丹;潘力;張世忠;周良輔;;外源性EGFP和TH基因修飾骨髓基質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞帕金森病猴模型腦內(nèi)移植后的跟蹤觀(guān)察[J];中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志;2006年05期

2 王彥惠,劉亞杰,盧洪流,劉振華,姜曉丹,徐如祥,周振軍,鄒雨汐,陳一招;成年大鼠紋狀體神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及分化[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年02期

本文編號(hào)：2641808