【摘要】： 目的:以H_2O_2損傷PC12細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的模型,探討硫化氫(hydrogen sulfide, H2S)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用,并初步探討硫化氫抗神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。 方法:用普通光鏡和Hoechst 33258熒光染色觀察H_2O_2作用24h后PC12細(xì)胞形態(tài)和核形態(tài)的變化;用四甲基偶氮唑藍(lán)(3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide,MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況;DNA Ladder抽提試劑盒和碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;雙氫羅丹明123(Dihydrohodamine 123, DHR123)染色后,鏡下觀察和FCM測(cè)定PC12細(xì)胞的DHR123熒光強(qiáng)度,以明確細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量的變化情況;羅丹明123(Rhodamine 123, Rh123)染色后,鏡下觀察和FCM測(cè)定PC12細(xì)胞的Rh123熒光強(qiáng)度,以了解細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的變化情況;Western Blot檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2和Caspase-3蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)果: 1.H_2O_2對(duì)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷作用:①M(fèi)TT結(jié)果顯示,用不同劑量H_2O_2(50、100、200、400、600μmol/L)作用PC12細(xì)胞24h后,細(xì)胞存活率隨藥物濃度的增加依次下降。②普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與正常細(xì)胞比較,細(xì)胞經(jīng)H_2O_2( 200、400μmol/L )處理24h后,細(xì)胞數(shù)明顯減少,細(xì)胞形態(tài)多為圓形,體積縮小,折光性減弱,貼壁能力降低。③細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33258染色后,在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),正常PC12細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻,為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光;經(jīng)H_2O_2( 200、400μmol/L )處理24h后,PC12細(xì)胞有大量的細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞。④細(xì)胞經(jīng)PI染色FCM結(jié)果顯示,PC12細(xì)胞自然凋亡率為3.2%,經(jīng)200和400μmol/L H_2O_2處理24小時(shí)后,分別可引起28.4%和45.1%的細(xì)胞凋亡(P0.01)。 2.H2S對(duì)H_2O_2損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用 2.1 H2S減輕H_2O_2對(duì)PC12細(xì)胞活性的抑制作用 ①M(fèi)TT結(jié)果顯示,400、800μmol/L NaHS均可明顯降低200、400μmol/L H_2O_2對(duì)PC12細(xì)胞的抑制率(P0.05)。 ②普通光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),與H_2O_2(200μmol/L )損傷組比較,合用NaHS(400μmol/L)處理后,圓形的,體積縮小的,折光性減弱,貼壁能力降低的PC12細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 2.2 H2S對(duì)抗H_2O_2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡 ①DNA Ladder結(jié)果顯示,200μmol/L H_2O_2作用PC12細(xì)胞24h后,細(xì)胞的DNA被裂解,在瓊脂糖凝膠電泳圖上呈現(xiàn)典型的梯形條帶,合用400μmol/L NaHS處理后能明顯抑制DNA梯帶的形成。 ②Hoechst 33258染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),與H_2O_2(200μmol/L)損傷組比較,合用NaHS (400μmol/L)處理的PC12細(xì)胞中細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的細(xì)胞數(shù)明顯減少,大部分細(xì)胞染色質(zhì)呈彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光。 ③FCM結(jié)果顯示,400和800μmol/L NaHS均可明顯抑制200和400μmol/L H_2O_2對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用(P0.05)。 3.H2S抗PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制 ①PC12細(xì)胞經(jīng)DHR123染色后,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),200μmol/L H_2O_2孵育PC12細(xì)胞3h后,合用400μmol/L NaHS處理的PC12細(xì)胞的DHR123熒光強(qiáng)度較200μmol/L H_2O_2損傷組明顯減弱;FCM定量分析結(jié)果顯示,合用400μmol/L NaHS處理的PC12細(xì)胞的DHR123平均熒光強(qiáng)度(8.03±2.08)較200μmol/L H_2O_2損傷組(13.81±2.52)明顯降低(P0.01)。表明H_2S對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成具有抑制作用。 ②PC12細(xì)胞經(jīng)Rh123染色后,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),200μmol/L H_2O_2孵育PC12細(xì)胞6h后,合用400μmol/L NaHS處理的PC12細(xì)胞的Rh123熒光強(qiáng)度較200μmol/L H_2O_2損傷組明顯增強(qiáng);FCM定量分析結(jié)果顯示,合用400μmol/L NaHS處理的PC12細(xì)胞的Rh123平均熒光強(qiáng)度(16.13±9.5)較200μmol/L H_2O_2損傷組(10.2±5.57)明顯升高(P0.01)。表明H_2S對(duì)H_2O_2降低PC12細(xì)胞的△Ψm具有抑制作用。 ③Western Blot結(jié)果顯示,200μmol/L H_2O_2孵育PC12細(xì)胞24h后,與正常對(duì)照組相比,Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯減少,合用400μmol/L NaHS能顯著減輕H_2O_2對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的抑制作用。 ④Western Blot結(jié)果顯示,200μmol/L H_2O_2孵育PC12細(xì)胞24h后,與正常對(duì)照組相比,Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯增加;合用400μmol/L NaHS后,與H_2O_2損傷組比較,PC12細(xì)胞的Caspase-3蛋白的表達(dá)明顯降低。 結(jié)論:1. H_2S對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用; 2. H_2S對(duì)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用可能與其抑制H_2O_2作用后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高,細(xì)胞△Ψm和Bcl-2表達(dá)的下降以及Caspase-3表達(dá)的增加有關(guān)。
【圖文】：

H2O2+NaHS NaHS圖 6 H2S 對(duì) PC12 細(xì)胞形態(tài)的影響（10×10）Fig 6 Effect of H2S on shape of PC12 cellsH2O2: 200μmol/L, NaHS: 400μmol/L2.2 H2S 對(duì)抗 H2O2誘導(dǎo) PC12 細(xì)胞凋亡 H2S 對(duì) H2O2誘導(dǎo) PC12 細(xì)胞 DNA 片斷化的影響采用 DNALadder 試劑盒，檢測(cè) H2S 對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 PC12 細(xì)胞 DNA 片斷化的果如圖 7 所示，PC12 細(xì)胞經(jīng) 200μmol/L H2O2作用 24 后，細(xì)胞的 DNA 被裂解，，糖凝膠電泳圖上呈現(xiàn)典型的梯形條帶，而合用 400μmol/L NaHS 處理后，能明顯A 梯帶的形成；正常組與 NaHS 處理組的 PC12 細(xì)胞均未出現(xiàn) DNA 梯帶。表明

圖 7 H2S 抑制 H2O2誘導(dǎo)的 PC12 細(xì)胞 DNA 片斷化g 7 H2S rescues DNA fragmentation of PC12 cells induced by HH2O2: 200μmol/L, NaHS: 400μmol/LH2O2誘導(dǎo) PC12 細(xì)胞核形態(tài)變化的影響oechst 33258 染色后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)。aHS 處理組的 PC12 細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻，為彌漫均勻O2作用 24h 后，PC12 細(xì)胞有大量的細(xì)胞核呈濃染致密細(xì)胞，而合用 400μmol/L NaHS 處理的 PC12 細(xì)胞中細(xì)粒狀熒光的細(xì)胞數(shù)明顯減少，大部分細(xì)胞染色質(zhì)呈彌漫HO誘導(dǎo) PC12 細(xì)胞凋亡的影響M control H2O2H2O2NaHSNaHS
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2640370