【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年人群中常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一,隨著社會(huì)人口老齡化其發(fā)病率逐年升高。神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)是AD患者腦中典型的病理學(xué)特征之一,NFTs的主要成分是異常過(guò)度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau聚集形成的雙螺旋細(xì)絲(paire helical filaments, PHFs)。研究表明,tau蛋白的過(guò)度磷酸化是AD病程發(fā)展的早期事件,而且AD患者的臨床癡呆程度與NFTs的數(shù)量密切相關(guān)。因此調(diào)節(jié)tau蛋白過(guò)度磷酸化為靶點(diǎn)的藥物可能是防治AD的有效方法之一。 肉毒堿(Carnitine)是賴(lài)氨酸的衍生物,其中左旋體具有生物學(xué)活性。本研究主要目的是探討L-肉毒堿(L-Carnitine)在wotmannin(WT)及GF-109203 X(GFX)引起的AD樣病理變化模型中的藥理作用及其相關(guān)機(jī)制。我們給予50mg/只/天L-Carnitine溶于大鼠每日飲水中連續(xù)14天,在給藥第8天時(shí)同時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練,在第15天給予大鼠側(cè)腦室聯(lián)合注射10μl濃度為100μM的PI3K特異性抑制劑wortmannin(WT)及PKC的特異性抑制劑GF-109203X(GFX)。側(cè)腦室注射24h后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試檢測(cè)大鼠空間記憶保留情況,之后取材進(jìn)行免疫印跡及免疫組化檢測(cè)。 1.L-Carnitine可改善WT/GFX引起的空間記憶保留障礙 結(jié)果顯示:側(cè)腦室注射WT/GFX24h后,大鼠找到隱藏平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng),搜尋軌跡雜亂,而預(yù)先給予L-Carnitine的大鼠找到平臺(tái)時(shí)間明顯縮短,搜尋軌跡接近正常,表明預(yù)先給予L-Carnitine能有效改善由WT/GFX所致的大鼠空間記憶障礙。 2. L-Carnitine可減輕WT/GFX引起的大鼠海馬tau蛋白過(guò)度磷酸化 免疫印跡結(jié)果顯示:總tau蛋白水平,各個(gè)實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯變化。側(cè)腦室注射WT/GFX24h后tau蛋白磷酸化在Ser199/202、Thr205、Ser396及Ser404位點(diǎn)明顯增強(qiáng),預(yù)先給予L-Carnitine能減輕Ser199/202及Thr205位點(diǎn)的磷酸化水平,不能減輕Ser396及Ser404位點(diǎn)的磷酸化水平。Ser214位點(diǎn)tau蛋白磷酸化各個(gè)實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯變化。 免疫組織化學(xué)檢測(cè)tau蛋白磷酸化及在海馬分布情況,結(jié)果顯示:L-Carnitine明顯降低由于側(cè)腦室注射WT/GFX24h后導(dǎo)致的PT205在大鼠海馬各區(qū)的陽(yáng)性染色,而增強(qiáng)Tau-1在海馬CA3區(qū)的陽(yáng)性染色。以上結(jié)果表明預(yù)先給予L-Carnitine能減輕WT/GFX導(dǎo)致的tau蛋白在PT205及Tau-1位點(diǎn)的過(guò)度磷酸化。 3.L-Carnitine可減輕WT/GFX誘導(dǎo)的大鼠海馬GSK-3β過(guò)度激活不依賴(lài)Akt激活 為了探討L-Carnitine減弱WT/GFX誘導(dǎo)的tau蛋白過(guò)度磷酸化的機(jī)制,研究發(fā)現(xiàn)注射WT/GFX后GSK-3β的非活性形式Ser9磷酸化的水平明顯降低,預(yù)先給予L-Carnitine可增加GSK-3β的Ser9磷酸化水平,而總GSK-3β水平在各組均無(wú)明顯變化,表明L-Carnitine能抑制WT/GFX所致的GSK-3β過(guò)度激活。Akt已被確定為是GSK-3β的上游調(diào)節(jié)因子,我們檢測(cè)大鼠海馬中AKT的Ser473磷酸化水平在注射WT/GFX后明顯降低,給予L-Carnitine后不能使其水平升高。以上結(jié)果提示:WT/GFX激活GSK-3β,從而導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化和空間記憶障礙,L-Carnitine下調(diào)GSK-3β的活性而減輕tau蛋白的過(guò)度磷酸化及改善記憶是不依賴(lài)于Akt的激活。 4.L-Carnitine增加c-Fos的表達(dá)從而提高記憶能力不是通過(guò)PKA/CREB通路實(shí)現(xiàn)的 我們進(jìn)一步研究了L-Carnitine對(duì)記憶保護(hù)的分子機(jī)制。我們用免疫組化檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)c-Fos的表達(dá)水平及分布,結(jié)果顯示,注射WT/GFX的大鼠海馬內(nèi)c-Fos的表達(dá)明顯較對(duì)照組有所降低,預(yù)先給予L-Carnitine能增加其表達(dá),尤其在CA1, CA3及DG區(qū)最為明顯。c-Fos是一種立早基因,它參與學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程。以上結(jié)果表明:L-Carnitine提高學(xué)習(xí)記憶與增加c-Fos的表達(dá)有關(guān)。為了研究L-Carnitine增加c-Fos表達(dá)的上游機(jī)制,我們檢測(cè)了PKA催化亞基及調(diào)節(jié)亞基和轉(zhuǎn)錄因子CREB的Ser133位點(diǎn)磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn):各實(shí)驗(yàn)組PKA的催化亞基無(wú)明顯差異,注射WT/GFX后導(dǎo)致PKA調(diào)節(jié)亞基顯著增高,給予L-Carnitine不能逆轉(zhuǎn)PKA調(diào)節(jié)亞基的水平。大鼠海馬錐體細(xì)胞內(nèi)CREB的Ser133位點(diǎn)磷酸化陽(yáng)性著色在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯差異。以上結(jié)果提示: L-Carnitine增加c-Fos表達(dá)的不是通過(guò)PKA/CREB通路實(shí)現(xiàn)的。 5. L-Carnitine對(duì)PP-2A催化亞單位酪氨酸307位點(diǎn)磷酸化的影響 我們檢測(cè)了PP-2A催化亞基總量(PP-2AC)和PP-2A催化亞單位Tyr307位點(diǎn)磷酸化(PP-2A的非活性形式)的水平。結(jié)果表明:各實(shí)驗(yàn)組之間PP-2AC未發(fā)生明顯變化;PP-2A催化亞單位Tyr307位點(diǎn)的磷酸化水平在WT/GFX處理后無(wú)明顯變化,而給與L-Carnitine后與對(duì)照組相比該位點(diǎn)磷酸化水平明顯下降。提示L-Carnitine對(duì)tau蛋白過(guò)度磷酸化及空間記憶障礙的保護(hù)作用可能與其上調(diào)了PP-2A有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2637414