【摘要】： 目的:研究Aβ對(duì)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的毒性作用,及UCP2在Aβ誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷中的可能作用。 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以損害大腦記憶和認(rèn)知功能為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,發(fā)病機(jī)制目前還不是很清楚�，F(xiàn)有大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床資料表明Aβ是各種病因誘發(fā)AD的共同通路,是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素,而自由基損傷是Aβ的主要毒性機(jī)制。自由基氧化應(yīng)激增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的損傷,而且因?yàn)楦叩拇x率、低水平的抗氧化劑、再生能力差等多種原因神經(jīng)元很容易受到自由基的影響。 解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2, UCP2)是線粒體內(nèi)膜解偶聯(lián)蛋白家族成員,廣泛分布于人類及嚙齒類動(dòng)物的多種器官。目前,UCP2的生理功能尚不十分清楚,較多研究表明,UCP2可通過“質(zhì)子漏”及氧化磷酸化解偶聯(lián)作用,降低ROS產(chǎn)生,對(duì)細(xì)胞形態(tài)、功能起到保護(hù)作用。因此,我們推測(cè)UCP2可能通過其降低ROS的功能,對(duì)Aβ誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。 方法:選用出生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠,無菌分離并培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,培養(yǎng)至9-10天,經(jīng)冷丙酮固定后,尼氏染色鑒定神經(jīng)元。將終濃度分別為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L Aβ_(1-40)加入到培養(yǎng)9天的海馬神經(jīng)元中,共同孵育24小時(shí)。觀察Aβ_(1-40)對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性作用,臺(tái)盤蘭染色法鑒定神經(jīng)元的存活率,檢測(cè)細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶和一氧化氮含量的變化。免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察UCP2的定位與表達(dá)變化。 結(jié)果: 1.原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元,倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,尼氏染色鑒定神經(jīng)元,細(xì)胞胞漿內(nèi)藍(lán)紫色顆粒及明顯的空泡狀核,為神經(jīng)元所特有,占細(xì)胞總數(shù)90%以上。細(xì)胞的數(shù)量與狀態(tài)可用于本研究。 2.不同濃度Aβ_(1-40)損傷海馬神經(jīng)元后,臺(tái)盤蘭染色結(jié)果顯示10μmol/L和20μmol/L Aβ_(1-40)損傷組與其它組相比有顯著性差異,細(xì)胞存活率明顯下降(n=3, P0.001);20μmol/L Aβ_(1-40)損傷組細(xì)胞上清液中LDH明顯增加,與其他組相比有顯著性差異(n=4, P0.05)。 3. 20μmol/L Aβ_(1-40)損傷組細(xì)胞上清液中NO明顯增加,與其它組相比有顯著性差異(n=4, P0.05)。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示UCP2在海馬神經(jīng)元胞漿中有表達(dá)。5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L Aβ_(1-40)損傷海馬神經(jīng)元后,神經(jīng)元胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色UCP2陽(yáng)性染色顆粒,其中20μmol/L Aβ_(1-40)損傷組陽(yáng)性顆粒尤其豐富,平均相對(duì)光密度與其他組相比有顯著性差異(P0.05)。 5. Aβ_(1-40)損傷海馬神經(jīng)元后,將NO與LDH、UCP2與NO做相關(guān)性分析,結(jié)果表明:在Aβ_(1-40)終濃度小于20μmol/L時(shí),NO與LDH之間存在顯著正相關(guān)(n=4, P 0.001, r=0.864),UCP2與NO之間存在顯著正相關(guān)(n=4, P 0.001, r=0.799)。 結(jié)論: 1.Aβ_(1-40)對(duì)海馬神經(jīng)元有損傷作用,自由基的產(chǎn)生增加可能是其損傷途徑之一。 2.在Aβ_(1-40)致海馬神經(jīng)元損傷中,UCP2可能通過降低活性氧的產(chǎn)生對(duì)海馬神經(jīng)元起保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元Fig. 1 The mature neurons in the primary hippocampal culture system. A: Normal neurons B:Hippocampal neurons stained with Thionine staining. (original magnification, ×400).二、Aβ1-40對(duì)海馬神經(jīng)元損傷作用形態(tài)學(xué)觀察顯示，20μM Aβ1 - 40作用神經(jīng)元 24h 后，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，輪廓模糊不清，胞質(zhì)染色變深，，核仁不明顯等特點(diǎn)。臺(tái)盤蘭染色結(jié)果顯示，存活神經(jīng)元拒染，死亡神經(jīng)元藍(lán)染。正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元存活率為 89.00±1.00%，5μmol/L、10μmol/L、20μmol/LAβ1 - 40損傷組海馬 神經(jīng)元存活率分別為 86.00±2.00%，61.67±0.58%，53.33±3.06%。其中對(duì)照組和 5μmol/L Aβ1 - 40損傷組細(xì)胞存活率沒有顯著性差異，10μmol/L 和 20μmol/L Aβ1 - 40損傷組細(xì)胞存活率明顯下降(n=3,P<0.001）。由表 1、圖 2 可以看出，不同濃度 Aβ1 -4 0作用海馬神經(jīng)元后，LDH含量均有變化，其中 20μmol/L Aβ?lián)p傷組細(xì)胞液中 LDH 含量明顯增高，

13圖 4 Aβ1 - 4 0損傷海馬神經(jīng)元 24h 后 UCP2 表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)Fig.4 The changes of UCP2 in hippocampal neurons exposed to Aβ1 - 4 0for 24h. Aindicated positive control group. B, C, and D indicated 5μM , 10μM , 20μM of Aβgroup respectively. E indicated negative control group. (original magnification, ×100, ×400). Scale bar, 30μm.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R749.16

【引證文獻(xiàn)】

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1 任璐;賀志雄;姜芹先;;腦組織UCP2的生物學(xué)特征及在體育科學(xué)中的應(yīng)用前景研究[J];吉林體育學(xué)院學(xué)報(bào);2012年02期

本文編號(hào)：2632047