發(fā)布時間：2020-04-17 18:13

【摘要】： 背景 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,其發(fā)病率隨年齡的增大而逐年增加,隨著人口老齡化進程的加快,老年性疾病已成為一個明顯影響人類健康的突出問題。阿爾茨海默病和心臟病、癌癥和中風(fēng)并列為威脅人類健康的四大疾病。而現(xiàn)有的治療方法如神經(jīng)遞質(zhì)替代、神經(jīng)生長因子和腦細胞活化劑等的治療,主要是改善癥狀,延緩病情發(fā)展,尚未取得令人滿意的效果。尋找針對病因的治療藥物,是AD治療的關(guān)鍵。β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid protein,Aβ)是老年斑(Senile Plaques,SP)中的主要成份,它的聚集被認為是導(dǎo)致阿爾茨海默發(fā)病的始發(fā)因素。以Aβ為靶的治療策略是指導(dǎo)藥物研究的一個極具希望的方向,它有別于以改善神經(jīng)元功能或臨床癥狀為主的治療方法,而是針對引起AD發(fā)病的病理因素進行治療。本研究根據(jù)Aβ_(1-42)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、形成過程和聚集原理設(shè)計出6種具有所期望的穩(wěn)定性、溶解性和活性的多肽抑制劑,用于阻止可溶性β-淀粉樣蛋白寡聚體和β-淀粉樣蛋白斑塊的形成。再通過以Aβ為靶進行的藥物篩選,確定出H102,并在體外觀察其對Aβ聚集的影響和對Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)細胞損傷的保護作用以及腦室注射H102對轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白(Amyloid Precursor Protein,APP)、Aβ表達的影響,為H102作為抗AD藥物開發(fā)提供了重要的前期實驗依據(jù)。 本研究共分為三個部分:(-)分子水平藥物篩選及H102對Aβ_(1-42)聚集的影響;(二)細胞水平藥物篩選及H102對神經(jīng)細胞的營養(yǎng)和保護作用;(三)H102對APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP和Aβ表達的影響。 材料和方法 (一)分子水平藥物篩選及H102對Aβ_(1-42)聚集的影響 1.藥物篩選 將上述6種多肽抑制劑和維生素E(Vitamin E,VE)在相同劑量(88.61μmol/L)和孵育條件下(37℃24h)與Aβ_(1-42)(22.15μmol/L)共同孵育,取樣進行Th-T檢測,比較6種藥物干預(yù)Aβ_(1-42)聚集的差別。 2.H102抑制Aβ聚集的研究 2.1量效關(guān)系研究用不同濃度(20μmol/L,40μmol/L,88.61μmol/L,200μmol/L)的H102和VE各10μl與(22.15μmol/L)的Aβ_(1-42)10μl在37℃24h條件下共同孵育,取樣做Th-T檢測,以研究其抑制Aβ聚集的量效關(guān)系曲線變化。 2.2時效關(guān)系研究Aβ_(1-42)10μl分別加入H102或VE各10μl(Aβ終濃度為11.07μmol/L,H102和VE終濃度為44.30μmol/L)37℃共同孵育,分別于孵育的12h、1d、3d、5d、7d取樣作Th-T檢測,分析其干預(yù)Aβ聚集的時效關(guān)系曲線變化。 3.電鏡觀察驗證藥物 將上述6種多肽抑制劑在相同劑量(88.61μmol/L)和孵育條件下(37℃5d)與Aβ_(1-42)(22.15μmol/L)共同孵育。作透射電鏡觀察Aβ單獨孵育后的聚集以及藥物干預(yù)后對Aβ聚集、纖維形成的影響。 (二)細胞水平藥物篩選及H102對神經(jīng)細胞的營養(yǎng)和保護作用 體外培養(yǎng)SY5Y細胞,以MTT代謝率測定細胞存活率作為篩選指標,篩選出具有保護神經(jīng)細胞SY5Y作用的多肽抑制劑。 1.多肽抑制劑對神經(jīng)細胞的營養(yǎng)作用 分為正常對照組、多肽抑制劑K7、L5、H100、H101、H102、H103 10μmol/L組、20μmol/L組、40μmol/L組; 2.多肽抑制劑對Aβ誘導(dǎo)的細胞損傷的保護作用 分為正常對照組、Aβ_(1-42)損傷組、Aβ_(1-42)+多肽抑制劑K7、L5、H100、H101、H102、H103 10μmol/L組、20μmol/L組、40μmol/L組; 3.H102的神經(jīng)營養(yǎng)作用實驗 分為對照組、20μmol/L H102組; 4.H102的神經(jīng)保護作用實驗 分為對照組、Aβ_(1-42)損傷組、Aβ_(1-42)+H102組。以MTT代謝率測定細胞存活率、細胞計數(shù)觀察細胞增長情況、LDH漏出率觀察細胞死亡率和形態(tài)學(xué)觀察H102對神經(jīng)細胞生長的影響。 (三)H102對APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP和Aβ表達的影響 APP轉(zhuǎn)基因小鼠,給予H102側(cè)腦室注射3μl/d,10d后,運用剛果紅和神經(jīng)免疫組織化學(xué)技術(shù)方法染色,測定模型動物腦內(nèi)APP、Aβ的表達水平。 結(jié)果 (一)分子水平藥物篩選及H102對Aβ_(1-42)聚集的影響 1.藥物篩選初步分析 以老化組的去本底熒光強度為100%,計算出各組藥物對Aβ_(1-42)的聚集和纖維形成的抑制率。最后選擇對Aβ具有良好抑制聚集和纖維形成的H102進行下一步的實驗分析。 2.H102藥效學(xué)研究 H102和VE可以明顯抑制Aβ_(1-42)的聚集,對Aβ聚集的抑制均有濃度依賴性,H102在每一濃度點的抑制率均大于VE;時效依賴關(guān)系顯示給藥各組各時間點熒光強度均較Aβ組明顯減弱,以H102的減弱最明顯。曲線半高峰出現(xiàn)時間(T_(1/2)),Aβ在給藥后第3天,而H102和VE則推遲至第4天左右。 3.電鏡觀察 Aβ_(1-42)在PBS溶液中單獨孵育具有自發(fā)聚集傾向:單獨孵育37℃5d,有大量Aβ纖維形成,直徑約8～10nm,長0.5～5μm,呈芒刺式晶狀聚集,有分枝,甚至交織成網(wǎng)狀,其間夾雜著少量呈聚集狀態(tài)的無定形結(jié)構(gòu);K7與Aβ_(1-42)共同孵育5d,出現(xiàn)大量Aβ纖維,直徑約10～12nm,長0.5～3μm,呈芒刺式晶狀聚集,有分枝,有交織成網(wǎng)狀的趨勢,其間可見大量呈聚集狀態(tài)的無定形結(jié)構(gòu);L5與Aβ_(1-42)孵育5d,形成的Aβ纖維明顯較細,直徑約4～8nm,長0.3～5μm,交織成網(wǎng)狀,其間夾雜著極少量呈聚集狀態(tài)的無定形結(jié)構(gòu);H100與Aβ_(1-42)孵育5d,形成大量Aβ纖維,直徑約10～18nm,長0.3～3μm,有交織成網(wǎng)狀的趨勢,可見大量呈聚集狀態(tài)的無定形結(jié)構(gòu);H101與Aβ共同孵育5d,有少量Aβ纖維形成,直徑約5～8nm,長0.5～5μm,交織成網(wǎng)狀,其間可見極少量呈聚集狀態(tài)的無定形結(jié)構(gòu);H102與Aβ共同孵育5d,Aβ纖維形成明顯減少且直徑變細,約3～6nm,長0.3～3μm,交織成網(wǎng)狀,其間夾雜著極少量呈聚集狀態(tài)的無定形結(jié)構(gòu);H103與Aβ共同孵育5d,少量Aβ纖維形成,直徑約5～8nm,長0.5～5μm,呈芒刺式晶狀聚集,交織成網(wǎng)狀,其間夾雜著少量呈聚集狀態(tài)的無定形結(jié)構(gòu)�？梢�,H102抑制Aβ聚集和纖維形成的效果最好。 (二)細胞水平藥物篩選及H102對神經(jīng)細胞的營養(yǎng)和保護作用 6種多肽抑制劑中有4種可使SY5Y細胞MTT代謝率增高,以H102的效果最好,可使SY5Y細胞MTT代謝率增高,LDH漏出率減少,細胞數(shù)量增加。Aβ_(1-42)對培養(yǎng)的神經(jīng)元具有毒性作用,表現(xiàn)為抑制細胞生長,MTT代謝率下降。6種多肽抑制劑都可以減輕Aβ_(1-42)引起的神經(jīng)元損傷,以H102效果最明顯,可使MTT代謝率升高,LDH漏出率減少,細胞數(shù)量增加,死細胞減少。提示H102具有神經(jīng)營養(yǎng)和保護作用。 (三)H102對APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP和Aβ表達的影響 9月齡轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分組分為模型組、藥物注射組、同月齡同背景C57BL/6J小鼠正常對照。藥物注射組側(cè)腦室給藥,其他兩組小鼠注射等體積生理鹽水,給藥10次后處死取鼠腦檢測:石蠟切片觀察剛果紅染色;免疫組化觀察APP、Aβ改變。提示H102可以降低APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP、Aβ表達水平。 結(jié)論 藥物篩選出H102對Aβ的β-折疊、聚集、纖維形成有很強的干預(yù)作用,并且對神經(jīng)細胞具有營養(yǎng)和保護作用。具體表現(xiàn)在:(1)干預(yù)Aβ聚集、纖維形成過程;(2)對Aβ_(1-42)誘導(dǎo)損傷的SY5Y細胞具有保護作用;(3)降低APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP、Aβ表達水平。
【圖文】：

本實驗結(jié)果顯示，Ap，、:老化組、Apl42十H102組和Apl二+vE組的熒光強度分別為112.79、81.39、84.76。以老化組的熒光強度為100%，，則各組的相對熒光強度見圖1一1，H102和VE相對熒光強度分別為72.16%和75.巧%，由此推斷H102和vE對Ap纖維形成的抑制率分別為27.84%和24.85%。一一”補畝一一一~一 一勤勤·8}.一 ...;;;….井「討… … AAApHD102VEEE圖1一1藥物對Ap熒光強度的影響天津市科技攻關(guān)培育項目USYFGPGXO71005

單獨孵育5d，出現(xiàn)大量Ap纖維，直徑約8一10lun，長0.5~5娜，呈芒刺式晶狀聚集，有分枝，甚至交織成網(wǎng)狀，其間夾雜著少量呈聚集狀態(tài)的無定形結(jié)構(gòu)，(圖1一4A，B);K7與Apl、共同孵育5d，有大量Ap纖維形成，并聚集成直徑約10一12lun，長0.5一3腳，呈芒刺式晶狀聚集，有分枝，有交織成網(wǎng)狀的趨勢，其間可見大量呈聚集狀態(tài)的無定形結(jié)構(gòu)，(圖1一4c);L5與Ap孵育5d，形成的Ap纖維明顯較細
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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本文編號：2631151