【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是常見的神經系統(tǒng)退行性疾病,其典型病理特征為老年斑的沉積和神經原纖維的纏結。老年斑的主要成分是β-淀粉樣多肽(beta-amyloid, Aβ),由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)在兩種蛋白酶即β-分泌酶和γ-分泌酶的先后裂解作用下產生。β-分泌酶也稱為BACEl (Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1),在Aβ的生成中起了至關重要的作用,是Aβ產生過程中的限速酶。很多研究證明膽固醇異常和AD存在著密切的聯(lián)系。臨床研究顯示高膽固醇血癥病人患AD的幾率也明顯增加。研究報道AD病人的腦中存在膽固醇代謝異常。動物實驗表明,長期給予家兔高膽固醇飲食會促進老年斑的生成,相反,用降膽固醇藥物能明顯降低Aβ的水平。肝X受體(Liver X receptor, LXR)是配體依賴性的核轉錄因子,可調控多個與膽固醇代謝有關的基因如ATP-結合盒轉運體Al (ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)和載脂蛋白E (Apolipoprotein E, ApoE)的表達,在維持膽固醇穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。LXR分為LXRa和LXRβ兩種亞型。LXR分布廣泛,在肝臟、脂肪組織和巨噬細胞分布較多,在腦內也有表達。LXR的配體包括天然的氧化甾醇(oxysterol)如：24(S)-羥基膽甾醇和27-羥基膽甾醇,以及人工合成的T0901317、GW3965。人工合成的LXR激活劑可以減少Aβ的生成,但機制不明。 那么,如果用人工合成的LXR激活劑T0901317處理APP/PS1轉基因小鼠后,腦內膽固醇穩(wěn)態(tài)是否發(fā)生改變?參與APP代謝的分泌酶的活性是否受到影響?激活LXR引起Aβ生成減少的原因是什么?針對這這些問題,本課題集中研究激活LXR對APP/PS1轉基因AD模型小鼠及對原代培養(yǎng)神經元膽固醇穩(wěn)態(tài)和β-分泌酶活性與Aβ生成的關系,以探討AD發(fā)病的相關分子機制,為臨床AD的預防和治療提供新的實驗依據。主要進行了以下兩方面的工作： 1激活LXR對AD模型小鼠腦內膽固醇穩(wěn)態(tài)和β-分泌酶活性的影響。運用real-time PCR技術和Western blot檢測LXR激活劑T0901317對LXR下游基因和蛋白的表達,結果顯示,T0901317上調APP/PS1轉基因小鼠腦內ABCA1和ApoE的表達。在T0901317處理組APP/PS1轉基因小鼠額葉皮層和海馬腦區(qū)總膽固醇含量沒有發(fā)生明顯改變,而膜膽固醇含量顯著低于對照組。與對照組相比,T0901317處理組的APP/PS1轉基因小鼠腦內老年斑的面積百分比減少,差異有統(tǒng)計學意義；ELISA方法檢測Aβ的水平,與對照組相比,T0901317處理組顯著減少了小鼠腦組織中Aβ40和Aβ42的含量。通過Western blot方法檢測BACE1蛋白表達水平,結果可見,T0901317處理組BACE1蛋白水平減低,提示激活LXR能減少APP/PS1轉基因小鼠腦內BACE1蛋白表達水平,能改善APP/PS1轉基因小鼠學習記憶能力。上述結果表明在APP/PS1轉基因動物,激活LXR具有降低BACE1蛋白表達、β-分泌酶活性和減少老年斑生成的作用。 2激活LXR下調β-分泌酶活性的機理研究。為揭示激活LXR降低β-分泌酶活性和減少老年斑生成的原因,應用real-time PCR、Western blot及免疫熒光染色技術深入研究從APP/PS1轉基因小鼠海馬提取的原代培養(yǎng)神經元經T0901317處理后ABCA1的表達變化、膜膽固醇含量的變化及對β-分泌酶活性的影響。我們發(fā)現,加入外源的膽固醇可以增加APP/PS1原代培養(yǎng)神經元膜膽固醇的含量,上調β-分泌酶的活性。用甲基-β-環(huán)糊精抽提膽固醇后發(fā)現,APP/PS1原代培養(yǎng)神經元膜膽固醇含量減少,并伴隨著β-分泌酶活性降低和Aβ生成減少。提示膜膽固醇的含量能影響到β-分泌酶的活性。T0901317處理細胞后,ABCA1 mRNA表達顯著高于對照組,膜膽固醇含量和β-分泌酶活性降低。為了進一步證明ABCA1在T0901317誘導的膜膽固醇水平降低過程中所起的作用,用ABCA1的抑制劑glyburide處理原代培養(yǎng)神經元,結果表明glyburide能夠逆轉T0901317的降低膜膽固醇含量和降低β-分泌酶活性的作用,提示T0901317下調β-分泌酶活性的能力需要ABCA1的參與。為了驗證LXR在T0901317上調ABCA1表達和下調β-分泌酶活性過程中是否起作用,用LXR的拮抗劑GGPP (geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)和T0901317共處理原代培養(yǎng)神經元,發(fā)現用LXR拮抗劑后,T0901317上調ABCA1表達、降低膜膽固醇和降低β-分泌酶活性這些作用幾乎消失,說明用LXR拮抗劑阻斷LXR能逆轉T0901317對原代培養(yǎng)神經元ABCA1、膜膽固醇含量和β-分泌酶的作用。 綜上所述,我們的實驗提示：激活LXR可改變APP/PS1轉基因小鼠腦內膽固醇的穩(wěn)態(tài),減少BACEl蛋白的表達,降低β-分泌酶活性和老年斑的生成。激活LXR是通過ABCAl下調膜膽固醇水平,從而使β-分泌酶活性降低和Aβ生成減少。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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1 姚君茹;高璐;于劍鋒;柴繼俠;王月華;馬麗香;陳祖林;李瑞錫;彭裕文;;p21活化激酶在APP/PS1轉基因AD小鼠模型海馬內表達的年齡變化(英文)[J];神經解剖學雜志;2008年01期

2 柴繼俠;姚君茹;于劍鋒;陳明軍;徐沖沖;朱新平;陳祖林;李瑞錫;彭裕文;;Drebrin和SYP在APP/PS1轉基因AD小鼠海馬內的表達與認知障礙的關系[J];神經解剖學雜志;2009年03期

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