【摘要】：背景:阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,該疾病最相關(guān)的組織病理學(xué)標(biāo)志是由β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)組成的細(xì)胞外老年斑和主要由過(guò)度磷酸化的Tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)。糖原合酶激酶-3(Glycogen synthase kinase-3,GSK-3)在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)。糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)是GSK-3的一個(gè)重要亞型。糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)過(guò)度激活可導(dǎo)致Tau蛋白過(guò)度磷酸化、突觸損傷和學(xué)習(xí)記憶障礙,在AD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。然而,GSK-3β在AD進(jìn)程中持續(xù)激活的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)在AD轉(zhuǎn)基因小鼠中GSK-3b乙�；缴�,但GSK-3b乙酰化在AD發(fā)生發(fā)展中的作用及其升高的機(jī)制尚不清楚。目的:探索GSK-3b乙酰化在AD的發(fā)生發(fā)展中的作用及其潛在的分子機(jī)制方法:在過(guò)表達(dá)Tau蛋白的HEK293細(xì)胞模型中,通過(guò)質(zhì)譜分析確定GSK-3b乙�；@著升高的位點(diǎn),并制備特異性抗體,用該抗體檢測(cè)AD模型動(dòng)物中GSK-3b該位點(diǎn)的乙酰化水平;在多種細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)GSK-3b賴氨酸15位點(diǎn)模擬乙�；c(diǎn)突變質(zhì)粒,運(yùn)用GSK-3b酶活性檢測(cè)法,免疫蛋白印記,免疫沉淀,免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)GSK-3b賴氨酸15位點(diǎn)模擬乙酰化后對(duì)其蛋白激酶活性,蛋白表達(dá)水平,泛素化水平及降解曲線的影響。在C57小鼠海馬CA1區(qū)注射GSK-3b賴氨酸15位點(diǎn)模擬乙�；c(diǎn)突變腺相關(guān)病毒,運(yùn)用小鼠行為學(xué),免疫蛋白印記,免疫沉淀,免疫組織化學(xué),免疫熒光等技術(shù)對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶及情緒,Tau蛋白的磷酸化,神經(jīng)炎癥相關(guān)因素(小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況)以及突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。在多種細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Tau全長(zhǎng)及乙酰轉(zhuǎn)移酶活性區(qū)域缺失的Tau-k18(-)質(zhì)粒,運(yùn)用免疫蛋白印記,免疫沉淀,免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Tau轉(zhuǎn)移酶活性對(duì)GSK-3b蛋白水平,乙�；�,泛素化水平及降解曲線的影響。運(yùn)用純化蛋白進(jìn)行體外乙�；膶�(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證Tau對(duì)GSK-3b的直接乙酰化作用。結(jié)果:1、在多種AD樣細(xì)胞和小鼠模型中均可見(jiàn)GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)乙�；缴咄ㄟ^(guò)質(zhì)譜分析確定在HEK293轉(zhuǎn)Tau模型中GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)存在乙酰化修飾,根據(jù)該結(jié)果制備特異性的識(shí)別GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)乙�；目贵w,并用該抗體檢測(cè)多種AD模型動(dòng)物(3xTg,APP/PS1,Tau+)發(fā)現(xiàn)GSK-3β乙�；缴�。2、GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)乙�；鰪�(qiáng)其酶活性并抑制其泛素化和降解構(gòu)建GSK-3βK15Q質(zhì)粒模擬GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)乙酰化,發(fā)現(xiàn)GSK-3βK15Q顯著增強(qiáng)其蛋白激酶活性,并顯著降低了GSK-3β蛋白的降解,且GSK-3β自身泛素化水平顯著降低。3、GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)乙�；瘜�(dǎo)致小鼠認(rèn)知能力損傷以及情緒障礙在C57小鼠海馬CA1區(qū)注射GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)模擬乙酰化點(diǎn)突變GSK-3βK15Q腺相關(guān)病毒,發(fā)現(xiàn)GSK-3βK15Q可以導(dǎo)致小鼠的認(rèn)知功能損傷和情緒障礙。4、GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)乙�；龠M(jìn)Tau的過(guò)度磷酸化及膠質(zhì)細(xì)胞的激活在C57小鼠海馬CA1區(qū)注射GSK-3βK15Q腺相關(guān)病毒,發(fā)現(xiàn)GSK-3βK15Q促進(jìn)了小鼠海馬區(qū)Tau的過(guò)度磷酸化,并顯著激活了小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。5、GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)乙酰化導(dǎo)致小鼠突觸可塑性損傷在C57小鼠海馬CA1區(qū)注射GSK-3βK15Q腺相關(guān)病毒,發(fā)現(xiàn)GSK-3βK15Q導(dǎo)致小鼠突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)下降。6、Tau促進(jìn)GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)乙酰化,增加GSK-3β蛋白水平和酶活性AD轉(zhuǎn)基因小鼠和細(xì)胞結(jié)果表明Tau增加了GSK-3β賴氨酸15位點(diǎn)乙�；�,并導(dǎo)致了GSK-3β的蛋白水平和酶活性增加。7、Tau的乙酰轉(zhuǎn)移酶區(qū)域介導(dǎo)了其對(duì)GSK-3β的蛋白水平,乙酰化水平的升高及泛素化水平降低。構(gòu)建消除乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的Tau-K18(-)質(zhì)粒,結(jié)果顯示:Tau的乙酰轉(zhuǎn)移酶區(qū)域介導(dǎo)了其對(duì)GSK-3β的蛋白水平,乙�；降纳呒胺核鼗浇档�。8、Tau蛋白可以直接乙�；疓SK-3β構(gòu)建Tau,Tau-K18(-)及GSK-3β的純化蛋白,體外乙酰化的實(shí)驗(yàn)證明Tau可以直接乙�；疓SK-3β,Tau-K18(-)廢除其對(duì)GSK-3β的乙酰化。結(jié)論:GSK-3β乙酰化可以增加其酶活性并促進(jìn)AD樣病變,Tau蛋白可以乙�；疓SK-3b,GSK-3b的乙酰化會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制其泛素化從而抑制其蛋白降解且增強(qiáng)其酶活性。背景:在癡呆癥發(fā)作前建立大腦儲(chǔ)備可能是預(yù)防阿爾茨海默病(AD)的一個(gè)有前途的策略,而如何啟動(dòng)早期認(rèn)知刺激尚不清楚�？紤]到不成熟的大腦對(duì)環(huán)境刺激更敏感,而且隨著年齡的增長(zhǎng),大腦的活力會(huì)下降,我們推斷早在胎兒時(shí)期就開(kāi)始對(duì)AD進(jìn)行認(rèn)知刺激是有效的。目的:探討孕期豐富環(huán)境是否可以預(yù)防子代的阿爾茲海默癥及其潛在的機(jī)制方法:在受孕后,將母代的AD轉(zhuǎn)基因小鼠(3x Tg AD)進(jìn)行孕期豐富環(huán)境(gestational environment enrichment,GEE)直到生產(chǎn)。子代小鼠放置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中并生長(zhǎng)至7月齡大,通過(guò)莫里斯水迷宮(Morris water maze)和情境恐懼條件反射測(cè)試(context fear-conditioning test)來(lái)評(píng)估7月齡子代小鼠的認(rèn)知能力。采用蛋白免疫印跡,免疫組織化學(xué),實(shí)時(shí)熒光定量PCR,染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP),電生理記錄,高爾基染色,活性實(shí)驗(yàn)以及夾心酶聯(lián)免疫分析等方法來(lái)深入了解GEE對(duì)胚胎及7-10月齡成年后代有益作用的機(jī)制。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)GEE顯著地保留了7-10月齡的AD模型鼠的突觸可塑性和記憶容量,同時(shí)伴隨著AD的標(biāo)志性病理的改善。GEE的有益作用伴隨著總的組蛋白的高乙酰化,包括BDNF啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)域的組蛋白高乙�；�,在胚胎和子代海馬中都具有強(qiáng)健的BDNF m RNA和蛋白表達(dá)。GEE使胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)表達(dá)增加并激活其受體(IGF1R)從而磷酸化Ca2+/鈣調(diào)素依賴性激酶IV(Ca MKIV)的酪氨酸位點(diǎn),并觸發(fā)其核易位,最終導(dǎo)致組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和BDNF轉(zhuǎn)錄的上調(diào)。IGF1的上調(diào)模擬了GEE的作用,而妊娠期抑制IGF1R或HAT則消除了GEE誘導(dǎo)的camkiv依賴性的組蛋白高乙�；虰DNF的上調(diào)。結(jié)論:通過(guò)孕期豐富環(huán)境可以激活I(lǐng)GF1R/Ca MKIV/HAT/BDNF信號(hào)可能是延緩AD進(jìn)展的一種有前途的策略。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2624885