【摘要】：阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,以進行性多項認知損害為主要表現(xiàn)的綜合征�；颊吣X中三大病理特征為淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失。近年來細胞內(nèi)Aβ、線粒體功能紊亂在AD發(fā)病中的作用已成為研究熱點。 淀粉樣蛋白結(jié)合醇脫氫酶(ABAD)位于線粒體基質(zhì),催化醛、酮、醇及類固醇等的氧化或還原。Aβ存在時,Aβ可與ABAD結(jié)合,使后者構(gòu)象改變,引起細胞內(nèi)氧化應激可致細胞死亡。而無Aβ環(huán)境下,ABAD在應激情況下對機體有保護作用。 為更好研究ABAD與Aβ結(jié)合后在AD發(fā)病中的作用及ABAD本身的生理作用,建立ABAD基因敲除小鼠模型是一研究基礎。目前已成功新建立神經(jīng)元內(nèi)選擇性ABAD基因敲除小鼠模型。本實驗對該小鼠一般性狀、特征,及線粒體功能,且對于引起人類MHBDD疾病的ABAD三個突變位點進行了初步的研究,為ABAD在線粒體內(nèi)的功能提供一些線索。 第一部分選擇性ABAD基因敲除對小鼠神經(jīng)細胞及其線粒體功能影響的初步研究 目的：選擇性神經(jīng)元內(nèi)ABAD基因敲除小鼠(ABAD ko小鼠)是新建立的小鼠模型,需要明確其基本特征及神經(jīng)細胞線粒體功能。探索神經(jīng)元內(nèi)ABAD表達量下降導致線粒體功能紊亂的可能原因。 方法：使用CREB PCR及FLOX PCR鑒定ABAD ko小鼠基因型。使用westernblot及免疫熒光染色鑒定ABAD在其大腦皮層及海馬表達量。TMRM熒光染色了解線粒體膜電位變化,MitoSOX熒光染色觀察線粒體氧自由基的釋放,用ATP試劑盒測定腦組織ATP含量,TUNEL試劑盒染色觀察神經(jīng)細胞凋亡情況。免疫熒光染色及Western blot觀察MHB、CypD及其它多種蛋白表達量的改變。用ImageJ對Western blot條帶及熒光染色進行量化,通過標準曲線換算ATP腦組織含量,對TUNEL陽性的細胞及神經(jīng)元進行計數(shù)等,用student t test比較基因敲除小鼠與對照小鼠的差異。 結(jié)果：ABAD ko小鼠基因型為CREB(+)且FLOX Δneo。Western Blot結(jié)果提不ABAD ko小鼠皮層及海馬ABAD的表達量明顯下降,密度值分別為皮層0.81±0.129vs.0.29±0.031, P=0.00098,海馬1.74±0.144vs.1.00±0.160,P=0.01894。免疫熒光染色提示ABAD ko小鼠上述部位ABAD表達量下降。MHB染色發(fā)現(xiàn)ABAD ko小鼠皮層MHB較wt小鼠明顯增多,密度值為11.14±0.609vs.6.92±0.354,P=0.018,海馬中ABAD ko小鼠MHB密度值較wt小鼠高,但P=0.48,無統(tǒng)計學差異。ABAD ko小鼠內(nèi)嗅皮層中TMRM染色明顯減低(1.00±0.081vs.0.75±0.049,P=0.036),運動感覺皮層無明顯降低(P=0.754)。MitoSOX染色在ABAD ko小鼠內(nèi)嗅皮層中明顯升高(1.00±0.062vs.1.37±0.085,P=0.004),而在運動感覺皮層無統(tǒng)計學差異(P=0.336)。腦組織ATP含量測定ABAD ko小鼠數(shù)值相對低,但兩組小鼠無統(tǒng)計學差異,可能取腦時間及部位不同影響結(jié)果(wt小鼠腦ATP含量2.54±0.282,ABAD ko小鼠ATP含量2.11±0.210,P=0.264)。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)7-8月ABAD ko小鼠皮層及海馬均有TUNEL陽性細胞,較對照組明顯升高,且內(nèi)嗅皮層區(qū)神經(jīng)元與總神經(jīng)細胞比值明顯下降,提示有神經(jīng)元丟失(ABAD ko小鼠內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元與總細胞比值0.298±0.069,wt小鼠0.67±0.050,P=0.032),而3-5個月的ABAD ko及wt小鼠大腦皮層或海馬中均無TUNEL陽性染色,且皮層運動感覺區(qū)及內(nèi)嗅皮層均無明顯神經(jīng)元丟失。另外Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)CypD、nrf2、SODII、GFAP在ABAD ko小鼠腦組織中明顯升高,COXIV、PSD95、Synaptophysin等表達量明顯下降。 結(jié)論：ABAD ko小鼠的基因型為CREB(+)且FLOX Δneo,皮層及海馬神經(jīng)元中ABAD表達量明顯降低,其底物MHB在上述部位堆積,為導致下游膜電位下降,ROS增多及細胞凋亡的原因之一。ABAD ko小鼠腦中CypD表達量升高,可能為導致線粒體功能紊亂的另一原因。ABAD ko小鼠大腦皮層中內(nèi)嗅皮層損傷嚴重。GFAP, SODII,Nrf2表達量上升,可能與星形膠質(zhì)細胞增生對抗細胞內(nèi)氧化應激有關,PSD95、Synaptophysin表達量降低,提示突觸功能受影響。 第二部分ABAD及三種突變體對氧化應激損害反應的研究 目的：人類疾病MHBDD是由ABAD基因某些位點的點突變引起。既往認為是突變造成ABAD對MHB酶活性下降導致MHB在腦內(nèi)堆積引起發(fā)病,而最近有報道認為還有其它途徑損傷線粒體。因此,本研究建立空載體轉(zhuǎn)染、wtABAD轉(zhuǎn)染及三個mutABAD轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細胞系,觀察wtABAD及三種突變體對氧化應激損害的反應,研究ABAD突變引起線粒體功能紊亂的可能途徑。 方法：建立穩(wěn)定表達的空載體,wtABAD,三個mutABAD(R130C, D86G, Q165H)的SK-N-SH細胞系。用Western blot檢驗ABAD表達量,AEC染色鑒定細胞形態(tài)及純度。選出合適的克隆后,加入H12O2誘導氧化應激,用MTT試劑盒、ATP試劑盒,測定各個細胞系中細胞的存活、生長及細胞內(nèi)ATP含量的變化。兩組間MTT數(shù)值及ATP含量差異用student t test檢驗。 結(jié)果：wtABAD組與空載體轉(zhuǎn)染的對照相比,H2O2處理24小時濃度為25uM,50uM,100uM組及處理48小時濃度為25uM,50uM組,MTT值明顯升高(P0.05)。wtABAD轉(zhuǎn)染的ABAD表達量不同的克隆里,對氧化應激均具有明顯保護作用,且ABAD表達量低,保護作用相對好,H2O2濃度高時保護作用更明顯。mutABAD組里,100uM H202處理細胞24小時后MTT發(fā)現(xiàn),R130C及Q165G組MTT值與對照相比無統(tǒng)計學意義差異(R130C:0.80±0.033VS.0.73±0.059,P=0.340:Q165H:0.80±0.033VS.0.89±0.050.P=0.162),D86G組數(shù)值明顯下降(0.80±0.033VS.0.48±0.011,P=O.011).250uM H202處理細胞24小時后MTT發(fā)現(xiàn),D86G.R130C數(shù)值明顯下降(D86G:0.50±0.076vs.0.08±0.002,P=0.001;R130C:0.50±0.076vs.0.15±0.021,P=0.001),Q165H數(shù)值上升(0.50±0.076vs.0.69±0.019,P=0.030)。 ATP結(jié)果提示H2021O0uM,200uM處理24小時后,對照組ATP含量較wtABAD組明顯降低(100uM:0.90±0.086vs.1.18±0.079,P=0.036;200uM:0.66±0.071vs.1.07±0.092,P=0.006).50uM H202處理,wtABAD至48小時ATP含量無明顯下降,而對照組ATP含量明顯下降(24hr:1.01±0.066vs.0.95±0.081,P=0.391;48hr:0.83±0.032vs.1.05±0.071,P=0.036).而三個mutABAD組,100uM及200uM H2O2處理細胞24小時后測定ATP發(fā)現(xiàn),ATP值與對照相比均無明顯升高。 結(jié)論：H2O2引起的氧化應激情況下,wtABAD轉(zhuǎn)染SK細胞克隆對細胞均有保護作用,而三種mutABAD轉(zhuǎn)染的細胞,MTT結(jié)果提示D86G、R130C可能對細胞存在進一步損傷作用,Q165H可能存在保護作用,ATP含量同對照組無明顯差異。推測突變通過影響其它底物酶活性或CypD相關途徑對線粒體功能產(chǎn)生損害,需要進一步實驗證實。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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1 張振馨,ZahnerGE,RomanGC,劉君,洪震,屈秋民,劉協(xié)和,張曉君,周玢,武成斌,唐牟尼,洪霞,李輝;中國北京、西安、上海和成都地區(qū)癡呆亞型患病率的研究[J];中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志;2005年03期

2 錢采韻;Alzheimer病β─淀粉樣蛋白研究進展[J];中國神經(jīng)精神疾病雜志;1996年01期

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本文編號：2624173