【摘要】：目的:抑郁癥(depression)是一種嚴(yán)重危及人類身心健康的情感性精神疾病。闡明抑郁癥發(fā)病機(jī)制,建立有效的治療策略始終是抑郁癥研究的重要內(nèi)容,也是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域熱點和難點。抑郁癥的病因錯綜復(fù)雜,環(huán)境因素和基因的交互作用影響著抑郁癥的發(fā)生發(fā)展。應(yīng)激,尤其是慢性負(fù)性應(yīng)激是抑郁癥發(fā)生發(fā)展的重要誘發(fā)因素。研究證實DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)等可通過對特定靶基因表達(dá)的表觀調(diào)控參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展和抗抑郁藥物作用發(fā)揮。作為一種新型的ncRNA,環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高豐度表達(dá),其表達(dá)具有細(xì)胞特異性和發(fā)育階段特異性,可作為微小RNA(microRNA,mi RNA)吸附海綿、結(jié)合RNA結(jié)合蛋白等方式調(diào)控靶基因表達(dá),參與神經(jīng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生、衰老等多種生理或病理生理過程。最新的臨床研究的數(shù)據(jù)表明,抑郁癥患者外周血中circRNAs存在差異表達(dá),差異表達(dá)的circRNAs可被抗抑郁藥物治療所逆轉(zhuǎn),提示circRNAs與抑郁癥發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。目前,抑郁癥相關(guān)腦區(qū)circRNA表達(dá)是否改變,差異表達(dá)的circ RNAs是否參與了抑郁癥發(fā)生發(fā)展等均未見報道�；诖�,本課題首次以circRNAs為切入點,通過建立慢性輕度應(yīng)激(chronic mild stress,CMS)致抑郁癥小鼠模型,綜合運用行為學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù),旨在:1)探討CMS致抑郁小鼠海馬CA1區(qū)mRNA和circRNA的表達(dá)變化規(guī)律;2)對差異表達(dá)的mRNA和circRNA進(jìn)行生物信息分析,構(gòu)建circRNA-mi RNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò),以期獲得新的參與抑郁癥發(fā)生發(fā)展的功能分子,為闡明應(yīng)激致抑郁癥發(fā)生機(jī)制,開發(fā)基于circRNAs的抑郁癥治療藥物拓寬思路。方法:1慢性輕度應(yīng)激致抑郁癥小鼠模型的建立50只ICR小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)5 d后,分為對照組和應(yīng)激組,對照組小鼠正常飼養(yǎng),應(yīng)激組小鼠按CMS操作流程進(jìn)行為期28 d的應(yīng)激處理(小鼠每天隨機(jī)進(jìn)行兩種應(yīng)激處理,應(yīng)激方式包括:24 h傾斜鼠籠、24 h禁食、24 h禁水、4°C冰水游泳(5 min)、光照過夜、空籠24 h、潮濕墊料24 h、擁擠24 h、束縛2 h、夾尾1 min等。應(yīng)激結(jié)束后,利用糖水偏愛測試(Sucrose preference test,SPT)、強(qiáng)迫游泳測試(Forced swimming test,FST)、開場測試(Open field test,OFT)和新穎抑制攝食測試(Novelty suppressed feeding,NSF)分別評價小鼠抑郁和焦慮行為。CMS造模成功后,小鼠斷頭取腦,分離海馬CA1區(qū)組織備用。2基于表達(dá)譜芯片的circRNA和mRNA表達(dá)變化規(guī)律研究分別選取對照組和CMS組小鼠海馬CA1區(qū)組織樣本(n=3),總RNA提取、定量,采用Arraystar表達(dá)譜芯片進(jìn)行circRNA和mRNA表達(dá)分析,差異表達(dá)的評價標(biāo)準(zhǔn)為fold change≥2或≤-2,P0.05。3基于實時定量PCR的差異表達(dá)circRNA和mRNA的再評價為驗證芯片數(shù)據(jù)的可靠性,分別隨機(jī)選取4種差異表達(dá)的circRNA和5種差異表達(dá)的mRNA,設(shè)計引物,qRT-PCR檢測其在對照組與CMS組的表達(dá)情況,通過2~(-ΔΔCt)法計算差異倍數(shù)。4差異表達(dá)的mRNA和circRNA的生物信息學(xué)分析對差異表達(dá)的mRNA和circRNA母源基因進(jìn)行GO(Gene ontology)分析和pathway分析,進(jìn)一步構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA的互作網(wǎng)絡(luò),挖掘circRNA可能的作用機(jī)制。結(jié)果:1.動物行為學(xué)結(jié)果顯示,與對照組相比,經(jīng)過28 d CMS處理后,CMS組小鼠表現(xiàn)出顯著的抑郁樣和焦慮樣行為,表現(xiàn)為:SPT測試中糖水偏愛的顯著下降(P0.01),FST中的漂浮不動時間顯著增加(P0.05);OFT中,中央停留時間(P0.01)顯著減少和自發(fā)活動顯著增加(P0.05),NSF測試中攝食潛伏期顯著延長(P0.05)。2.qRT-PCR驗證結(jié)果提示表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)基本可靠,表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)提示抑郁癥小鼠海馬CA1區(qū)存在circRNA和mRNA的差異表達(dá)。與對照組比較,CMS小鼠海馬CA1區(qū)差異表達(dá)的mRNA 448種,差異表達(dá)的circRNA 3215種。GO分析結(jié)果提示,除了已有研究報道的突觸、神經(jīng)胞體組分、受體等相關(guān)功能/基因差異變化外,神經(jīng)投射、activin受體通路、淋巴細(xì)胞遷移等相關(guān)mRNA和circRNA母基因存在差異。Pathway分析結(jié)果提示甾體生物合成、Hippo通路、TGF-beta通路等相關(guān)通路mRNA和circRNA母源基因存在差異,提示上述通路參與抑郁癥發(fā)生的可能性,其具體功能有待驗證。基于circRNA可作為miRNA吸附海綿的作用機(jī)制,選取差異表達(dá)的circ-SYNDIG1.1和circ DTNB.377進(jìn)行circRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,進(jìn)一步獲得了其可能調(diào)控的靶mi RNA及其下游mRNA分子。結(jié)論:1.CMS致抑郁癥小鼠海馬CA1腦區(qū)存在mRNA和circRNA的差異表達(dá),其中1845種circRNA表達(dá)上調(diào),1370種circRNA表達(dá)下調(diào)。2.差異表達(dá)的mRNA/circRNA經(jīng)生物信息學(xué)分析,獲得了其可能發(fā)揮作用的下游靶分子/信號通路,為進(jìn)一步探討候選circRNA在應(yīng)激致抑郁癥發(fā)生中的功能及其分子機(jī)制提供了初步實驗依據(jù)。
【圖文】：

22圖 2 CMS 能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為g.2 CMS-induced significant depressive-like behaviors in minificantly decreased sucrose preference A. without affecting the SPT. B. CMS increased the immobility time C. without ecy to floating D. in the FST. *P<0.05, **P<0.01 versus t=10 -15 per group.

23圖 3 CMS 誘發(fā)小鼠產(chǎn)生焦慮樣行為.3 CMS exposure induced significant anxiety-like behaviors in mMS significantly decreased time spent in the central zone. Bsed the crossing activities in the OFT. C. CMS increased latg. D. without affecting the total feeding in the NSF. *P<0.05, ** the Na ve group. n =10 -15 per group.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R749.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2622189