【摘要】：研究背景 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病及高血壓等全身病變、青光眼等神經(jīng)退行性病變、外傷、炎癥等等均可引起視神經(jīng)的損害,導致視功能的嚴重喪失,甚至法定盲。而視神經(jīng)損害和視功能喪失的中心環(huán)節(jié)是視網(wǎng)膜節(jié)細胞的損害。 視網(wǎng)膜節(jié)細胞的損傷分為兩個步驟：原發(fā)性的損傷和繼發(fā)性的凋亡�，F(xiàn)有的視神經(jīng)的保護治療更多地針對原發(fā)性的損傷,如控制青光眼患者的眼內(nèi)壓、控制糖尿病性視神經(jīng)視網(wǎng)膜病變患者的血糖水平及糖皮質(zhì)激素抑制炎癥反應(yīng)。然而,越來越多的跡象表明即使眼內(nèi)壓控制得很理想、血糖也被降至標準范圍,視神經(jīng)的損傷及節(jié)細胞的凋亡仍繼續(xù)加重,最終難以避免視功能的進一步喪失。目前針對視神經(jīng)損傷機制的研究目前主要集中在建立RGC凋亡模型的基礎(chǔ)上研究其凋亡的發(fā)生與發(fā)展。因此在理想的RGC凋亡模型的基礎(chǔ)上,阻斷繼發(fā)性凋亡的研究成為急切需求,尋找分子水平的凋亡啟動因子成為重點。 目前針對視神經(jīng)損傷機制研究建立的RGC凋亡模型大多參差不齊,分為定性或定量、部分橫斷或完全橫斷視神經(jīng)、按病因分為機械性、高眼壓性、缺血性、毒性或糖尿病性等等。由于視神經(jīng)疾病種類多種多樣,許多發(fā)病機制不明,故很難用一個統(tǒng)一的標準去評判各類實驗研究結(jié)果。其中,視神經(jīng)完全橫斷動物模型是將視神經(jīng)自視交叉前任一部位切斷,造成所有RGC軸突完全斷離。這種模型優(yōu)點是各實驗動物致傷量一致,觀察再生時不受殘留未受損軸突的影響。而以往的橫斷模型是將視神經(jīng)暴露后,單純于球后離斷之。這致使眼球及視網(wǎng)膜的供血受到嚴重影響,無法真實地進行節(jié)細胞凋亡的研究。我們的實驗采用暴露視神經(jīng)后,顯微剪縱行剝開視神經(jīng)外膜,在外膜內(nèi)、球后2mm處離斷視神經(jīng)的方法,使得眼球及視網(wǎng)膜的血供不受影響,相對真實地建立了視神經(jīng)橫斷模型。 淀粉樣蛋白(amyloid)是一種沉積于血管壁和結(jié)締組織中透明均勻性物質(zhì)。當組織內(nèi)出現(xiàn)淀粉樣蛋白沉著時,特別是浸潤某些重要器官產(chǎn)生淀粉樣蛋白過度沉積時,不但可以逐漸損傷并破壞正常組織功能,而且是一種進行性和預(yù)后不良的疾病。β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein Aβ)是參與神經(jīng)損傷及致細胞凋亡的非常重要的因子,它是β-淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)的一種降解產(chǎn)物。APP是廣泛表達在多種組織和腦組織各部位神經(jīng)元細胞膜表面的一種跨膜蛋白,多種細胞因子(IL-1、IL-4、NGF、TGF-β、bFGF等)和某些外源性刺激如熱休克、創(chuàng)傷等均可影響APP基因的表達。APP是炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、凝集反應(yīng)及組織損傷,修復等生理過程中的重要物質(zhì)。APP可被α、β、γ三種分泌酶降解。β和γ,分泌的降解產(chǎn)物為β-淀粉樣蛋白,后者具有細胞毒性,可導致細胞凋亡。Alzheimer病(AD)是一種發(fā)病率最高、危害最大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病。Hardy J等的研究較早表明Ap沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié),減少Ap沉積或清除已形成的淀粉樣蛋白斑塊可以有效預(yù)防和治療AD。作為重要的致神經(jīng)退變因子,Ap與眼科的相關(guān)研究,特別是與視神經(jīng)損傷的研究較少。我們假設(shè)其在視神經(jīng)損傷中發(fā)揮了如同中樞神經(jīng)系統(tǒng)一樣重要的作用,并用實驗證實Ap在視神經(jīng)損傷模型中的表達及其機制。 視網(wǎng)膜節(jié)細胞通常在受到損傷或退行性變后軸突不能再生,但最近10余年來的研究表明我們可以通過激活節(jié)細胞固有的生長狀態(tài)、維持它們的生存能力及抵制外環(huán)境的抑制信號達到部分再生的狀況[30]。主要為以下三個方面：1.阻止神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的繼續(xù)發(fā)生。例如：谷氨酸受體拮抗劑；鈣通道阻滯劑；一氧化氮(NO)與其合酶(NOS)抑制劑；基因調(diào)控凋亡；自由基清除劑和抗氧化劑；熱休克蛋白；鋅等。2.促進新的神經(jīng)節(jié)細胞的再生。例如：補充外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；視神經(jīng)干細胞移植；雪旺細胞玻璃體腔移植等。3.修復已發(fā)生凋亡的神經(jīng)節(jié)細胞。例如：補充外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；視神經(jīng)干細胞移植；雪旺細胞玻璃體腔移植以及各種中醫(yī)藥等。這些研究成果使得視神經(jīng)的功能恢復成為可能,但是目前視神經(jīng)保護藥的種類和效果還相當有限。中醫(yī)藥在視神經(jīng)保護方面有較大的優(yōu)勢,在積極探索視神經(jīng)損傷的發(fā)病機理的同時,加快中醫(yī)藥在視神經(jīng)保護方面的臨床和基礎(chǔ)研究,發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢,必將提高我國防盲治盲水平。烏雞白鳳丸有效成分(Bak Foong Pills, BFP)是一種廣泛用于治療婦科疾病的傳統(tǒng)中藥,并具有類雌激素樣作用活性,如降低血壓、增加血管舒張度、減少血清三酰甘油、抗血小板活性以及刺激腦內(nèi)DA釋放等多種藥理作用。另外,謝俊霞等[54,55]研究表明BFP可以抑制海馬神經(jīng)元凋亡,具有神經(jīng)保護作用。而BFP抗神經(jīng)元凋亡作用在眼科鮮有報道。我們的實驗以SD大鼠為研究對象,觀察BFP干預(yù)處理對視神經(jīng)損傷導致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡是否具有保護作用,并對其機制進行了初步探討。 目的 本研究在建立大鼠視神經(jīng)橫斷模型的基礎(chǔ)上觀察β-淀粉樣蛋白在視神經(jīng)病變時眼部的表達及其發(fā)生機制。并探討了中藥烏雞白鳳丸有效成分(BFP)對其表達的影響作用。 方法 1.改良大鼠視神經(jīng)橫斷模型建立：健康SD大鼠54只,隨機分為三組,分別為損傷組(model組)、假損傷對照組(sham組)、正常對照組(control組)。Model組24只大鼠,左眼為損傷眼,右眼為未損傷眼,作為對照,按損傷后存活時間不同分為3h組、48h組、7d組、14d組,每組6只,暴露視神經(jīng),使用顯微剪縱行剝開視神經(jīng)外膜,在外膜內(nèi)、球后2 mm處離斷視神經(jīng)；Sham組24只大鼠,左眼為假損傷眼,右眼為未損傷眼,作為對照,按損傷后存活時間不同分為3h組、48h組、7d組、14d組,每組6只,僅暴露視神經(jīng)但不進行離斷損傷；6只為正常對照組。均于處死前7d采用雙上丘注射5%熒光金(FG)標記雙眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞。取眼球標本并分離視神經(jīng)至視交叉。視網(wǎng)膜鋪片熒光照相,RGCs計數(shù)及RGCs標識率計算。并對視網(wǎng)膜切片進行蘇木精-伊紅染色,觀察視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜形態(tài)學變化。 2.β-淀粉樣蛋白在視神經(jīng)橫斷大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的表達及機制：將81只健康成年S-D大鼠以第一部分相同的納入標準入組。其中損傷組(model組)和假損傷對照組(sham組),每組36只。均使用第一章中所述的步驟在model組大鼠建立視神經(jīng)橫斷損傷模型,均損傷左眼。按損傷后存活時間不同分為3h組、48h組、7d組、14d組,每組9只,暴露視神經(jīng),使用顯微剪縱行剝開視神經(jīng)外膜,在外膜內(nèi)、球后2 mm處離斷視神經(jīng)；Sham組36只大鼠,左眼為假損傷眼,右眼為未損傷眼,作為對照,按損傷后存活時間不同分為3h組、48h組、7d組、14d組,每組9只,僅暴露視神經(jīng)但不進行離斷損傷；9只作為正常對照組(control組)。分別于造模成功后3h、48h、7d、14d(每個時間段3只大鼠)處死動物。①采用Western-blotting技術(shù)檢測model組、sham組及control組四個時間點的β-淀粉樣蛋白的表達情況；②使用免疫組化技術(shù)觀察model組、sham組及control組四個時間點的β-淀粉樣蛋白的表達情況；③使用RT-PCR技術(shù)檢測model組、sham組及control組四個時間點的Bcl-2 mRNA、Bax mRNA以及Caspase-3 mRNA的在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達水平；并以control組大鼠為對照。 3.BFP保護視網(wǎng)膜節(jié)細胞作用研究：將48只健康成年S-D大鼠隨機分為四組：A組(損傷+BFP治療組)、B組(損傷組)、C組(損傷+PBS對照組)和D組(正常大鼠對照組)。每組12只大鼠,左眼為損傷眼,右眼為正常對照組。A組制成視神經(jīng)橫斷損傷大鼠模型,并在損傷眼玻璃體腔注射BFP溶液(100ug/m1)10ul；B組制成視神經(jīng)橫斷損傷大鼠模型；C組制成視神經(jīng)橫斷損傷大鼠模型,損傷眼玻璃體腔注射同等體積PBS；D組不進行視神經(jīng)損傷及玻璃體腔注射。選擇第二部分中p-淀粉樣蛋白表達水平最高的時間點,①采用Western-blotting技術(shù)檢測model組及sham組四個時間點的β-淀粉樣蛋白的表達；②采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測Bcl-2 mRNA、Bax mRNA以及Caspase-3 mRNA在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達水平。 結(jié)果 1.成功建立改良大鼠視神經(jīng)橫斷模型：①FG逆行標記進行RGC計數(shù)及RGCs標識率：model組各時間點損傷眼RGCs計數(shù)(3h組152.06±15.21,48h組103.19±10.55,7d組61.89±27.38,14d組52.10±20.56)與control組(3h組195.16±22.12,48h組188.26±16.16,7d組187.76±21.19,14d組199.46±13.67)比較,差異均有顯著性（P0.05)。而sham組與control組比較,差異無顯著性(P0.05)。②組織病理改變：model組HE染色：視神經(jīng)橫斷損傷后,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層出現(xiàn)核固縮、視網(wǎng)膜各層變薄、細胞排列紊亂、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞減少,致傷后不同時間點上述改變的程度不同,表現(xiàn)為隨損傷后時間延長而加重。Sham組及control組未見明顯病理改變。 2.β-淀粉樣蛋白在視神經(jīng)橫斷大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)的表達上調(diào),同時Bcl-2下調(diào)、Bax及Caspase-3上調(diào)：①應(yīng)用Western-blotting技術(shù)檢測：model組各時間點β-淀粉樣蛋白表達水平與control組比較,均上調(diào),且差異有顯著性(P0.05)。其中,以48h時間點上調(diào)的最高。而sham組與control組比較,差異無顯著性(P0.05)。②應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察：光鏡下model組視網(wǎng)膜節(jié)細胞層、內(nèi)核層及內(nèi)叢狀層均可見β-淀粉樣蛋白明顯表達,呈黃色～棕褐色顆粒狀分布。且48h時間點的著色最深、數(shù)量最多。而sham組與control組大鼠視網(wǎng)膜及視神經(jīng)內(nèi)未見明顯β-淀粉樣蛋白的表達。③應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測：model組Bcl-2 mRNA(抗凋亡因子)表達下調(diào),而Bax mRNA(促凋亡因子)與Caspase-3 mRNA(促凋亡因子)的表達上調(diào)。亦即：Bcl-2/Bax的比值下降,而Caspase-3 mRNA表達水平上升,且與control組比較,差異有顯著性(P0.05)。同時,sham組與control組比較,差異無顯著性(P0.05)。 3.BFP下調(diào)視神經(jīng)橫斷大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)p-淀粉樣蛋白表達,同時上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax及Caspase-3表達：①應(yīng)用Western-blotting技術(shù)檢測：A組(損傷+BFP治療組)與B組(損傷組)相比,p-淀粉樣蛋白的表達明顯下降,差異有顯著性(P0.05)。但與D組比較,β-淀粉樣蛋白的表達水平仍處于升高狀態(tài),差異有顯著性(P0.05)。同時,B組(損傷組)與C組(損傷+PBS對照組)比較,差異均無顯著性(P0.05)。表明玻璃體腔注射這一干預(yù)方式對,β-淀粉樣蛋白表達的影響沒有意義。②應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測：A組(損傷+BFP治療組)與正常對照組大鼠比較,仍有Bcl-2/Bax的比值下降和Caspase-3 mRNA表達水平上升,且差異有顯著性(P0.05)。但是,A組(損傷+BFP治療組)與B組(損傷組)比較,Bcl-2/Bax的比值下降和Caspase-3 mRNA表達水平上升的情況明顯減輕,且差異有顯著性(P0.05)。同時,B組(損傷組)與C組(損傷+PBS對照組)比較,差異均無顯著性(P0.05)。表明玻璃體腔注射這一干預(yù)方式對Bcl-2mRNA、Bax mRNA以及Caspase-3 mRNA表達的影響沒有意義。 結(jié)論 1.應(yīng)用顯微剪縱行剝開視神經(jīng)外膜,在外膜內(nèi)、球后2 mm處離斷視神經(jīng)；能成功建立改良視神經(jīng)橫斷損傷動物模型。 2.β-淀粉樣蛋白在視神經(jīng)橫斷大鼠的視網(wǎng)膜中的表達顯著上調(diào),推測β-淀粉樣蛋白參與視網(wǎng)膜節(jié)細胞的凋亡過程。而且β-淀粉樣蛋白致視神經(jīng)損傷的機制是通過Bcl-2/Bax、Caspase-3途徑起作用的。 3.烏雞白鳳丸有效成分(BFP)玻璃體腔注射通過下調(diào)β-淀粉樣蛋白的水平、調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax和Caspase-3的表達發(fā)揮保護視網(wǎng)膜節(jié)細胞作用。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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本文編號：2616415