【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的典型病理表現(xiàn)出現(xiàn)之前,“自噬”已經(jīng)廣泛存在。在這一階段,β淀粉樣蛋白(amyloidβ-peptide, Aβ)衍生的可擴(kuò)散性配體(Aβ-derived diffusible ligands, ADDLs)是核心致病因子。但是它與AD“自噬激活”的關(guān)系尚未明確。本研究旨在明確ADDLs體外誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞自噬激活的效應(yīng),并初步探討其作用機(jī)制。 從以下三方面開(kāi)展工作：1) ADDLs體外對(duì)SH-SY5Y自噬的激活作用。參照相關(guān)文獻(xiàn)制備ADDLs,并對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)鑒定。用免疫印跡(western blot, WB)檢測(cè)不同劑量和不同作用時(shí)間ADDLs誘導(dǎo)自噬激活的標(biāo)志物(marker)微管相關(guān)蛋白-Ⅰ(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達(dá)情況；以上實(shí)驗(yàn)用cAMP作為自噬誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照。2)研究ADDLs二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)SH-SY5Y自噬的激活的影響。制備不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的ADDLs,利用圓二色譜儀對(duì)不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的ADDLs進(jìn)行具體數(shù)據(jù)分析,計(jì)算其中α螺旋和β折疊的含量。用WB檢測(cè)不同二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)ADDLs誘導(dǎo)LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的影響；用免疫熒光檢測(cè)LC3的細(xì)胞定位；用Lyso-tracker示蹤和吖啶橙染色觀察溶酶體激活情況。3)研究ADDLs誘導(dǎo)SH-SY5Y自噬的通路。檢測(cè)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)激活情況,通過(guò)檢測(cè)其底物p-p70、總p70(t-p70)以及p-p70/p70(t-p70)比值,來(lái)判斷ADDLs誘導(dǎo)自噬的細(xì)胞通路。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1) ADDLs體外誘導(dǎo)SH-SY5Y自噬的激活作用具有時(shí)間和劑量依賴性。時(shí)間為0 h、12 h、和24 h時(shí),ADDLs誘導(dǎo)LC3表達(dá)量依次升高,在作用48 h時(shí),LC3表達(dá)量開(kāi)始下降；劑量為0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L時(shí),誘導(dǎo)LC3表達(dá)量逐漸增加,當(dāng)劑量增加到80μmol/L時(shí),LC3表達(dá)量開(kāi)不再增加。2) ADDLs在組裝過(guò)程中出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,這種變化可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的自噬激活,聚合時(shí)間為12～24 h時(shí),α螺旋含量下降至4.5%,β折疊的含量增加至13.9%,在此期間內(nèi),可以檢測(cè)到LC3表達(dá)量增加,以LC3-Ⅱ增加更明顯。免疫熒光結(jié)果顯示顆粒狀“自噬小體”形態(tài)特征出現(xiàn),以聚合24 h的ADDLs樣品作用效果為明顯,伴隨Lyso-tracker陽(yáng)性標(biāo)記和吖啶橙著色顆粒的增加。3)在0-24 h范圍內(nèi),隨作用物聚集時(shí)間的延長(zhǎng),p-p70水平下降、總p70(t-p70)變化不明顯,p-p70/p70(t-p70)比值下降,說(shuō)明mTOR的活性被抑制,提示ADDLs誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬與mTOR途徑相關(guān)。 綜上所述,ADDLs的作用時(shí)間、劑量和二級(jí)結(jié)構(gòu)變化決定了SH-SY5Y細(xì)胞的自噬激活,具有LC3-Ⅱ陽(yáng)性反應(yīng),并且與mTOR的抑制有關(guān)。本研究為進(jìn)一步探討ADDLs在AD“自噬激活”中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

LC3Bee)。一actin--+{篡麟囂緩翼篡圖3W七 stemblot檢測(cè)ADDLs誘導(dǎo)自噬的時(shí)間依賴性 Fig.3WestemblotofantoPhagyindueedbyADDLsofdi價(jià) entineubationtimesLanel:ADDLs誘導(dǎo)時(shí)間為oh;LaneZ:ADDLs誘導(dǎo)時(shí)間為12h;Lane3:ADDLs誘導(dǎo)時(shí)間為 24h;Lane4:ADDLs誘導(dǎo)時(shí)間為48h.

ADDLs的誘導(dǎo)劑量為40協(xié)moFL，誘導(dǎo)時(shí)間為24h，ADDLs聚合時(shí)間為分別為Oh、12h、24h。分別用叮l定橙和切50一traeker對(duì)溶酶體進(jìn)行染色。可以看出溶酶體明顯增加(圖10，圖11，圖12，，圖13)。在小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤NZa中進(jìn)行同樣條件的溶酶體檢測(cè)，結(jié)果與在SH一SYSY細(xì)胞中的結(jié)果一致(圖14，圖15，圖16)。圖10切50一tracke:檢測(cè)溶酶體 Fig.10LysosomesdeeoratingbyLyso一tracker左:ADDLS聚合時(shí)間為24h;范!:陰性對(duì)照
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2616277