【摘要】：背景抑郁癥是由社會、生理、心理等多種因素相互作用而導(dǎo)致的疾病,其中應(yīng)激是抑郁癥發(fā)病的重要誘因之一。世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,目前全球約有3億抑郁癥患者,5000萬癡呆患者[1]。由于缺乏有效的治療措施,預(yù)計(jì)至2030年抑郁癥將上升至世界疾病負(fù)擔(dān)首位。因此,深入認(rèn)識抑郁的發(fā)生、探索干預(yù)抑郁的有效措施,具有極其重要的醫(yī)學(xué)及社會意義。磁共振檢測顯示,抑郁患者的一些腦區(qū),如額葉、海馬、顳葉、丘腦、紋狀體和杏仁核均存在體積減小。抑郁患者尸檢結(jié)果也顯示海馬、杏仁核、前額葉皮質(zhì)和紋狀體等腦區(qū)存在明顯的萎縮。海馬是大腦內(nèi)側(cè)顳葉的邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu),承擔(dān)空間學(xué)習(xí)記憶和導(dǎo)航的重要功能,同時(shí)也參與情緒調(diào)節(jié)。海馬在抑郁發(fā)病過程中的作用受到越來越多的關(guān)注。持續(xù)的空間定位訓(xùn)練會增加海馬的體積、海馬神經(jīng)發(fā)生、突觸發(fā)生以及樹突棘數(shù)量。給予抑郁患者認(rèn)知功能相關(guān)的學(xué)習(xí)任務(wù)后,患者的臨床癥狀可得到改善。因此,通過對改善海馬功能能否改善抑郁行為的研究,具有十分重要的意義,尋找出其中的關(guān)鍵性分子對闡明抑郁發(fā)病機(jī)制和制定治療策略的也尤為重要。小分子RNA(MicroRNAs,miRNA)是長度約22-24個(gè)核苷酸的非編碼RNA的一個(gè)亞類,miRNA主要通過影響靶信使RNA(mRNA)表達(dá)而發(fā)揮其功能,每個(gè)miRNA可能潛在地靶向數(shù)百種不同的mRNA。研究表明,miR-191參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)元活性、參與學(xué)習(xí)或記憶過程、與神經(jīng)元凋亡過程相關(guān)以及參與激活蛋白激酶A的活性等,但miR-191在抑郁發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不十分清楚。目的探究空間學(xué)習(xí)能否改善抑郁大鼠的抑郁行為;分析空間學(xué)習(xí)改善大鼠抑郁的海馬蛋白組學(xué)基礎(chǔ);闡明miR-191在空間學(xué)習(xí)改善大鼠抑郁中的作用及機(jī)制。方法采用21天慢性不可預(yù)知性應(yīng)激(Chronic unpredicted stress,CUS)復(fù)制大鼠抑郁模型。采用曠場實(shí)驗(yàn)(Open field test,OFT)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(Forced swimming test,FST),糖水偏好實(shí)驗(yàn)(Sucrose preference test,SPT)綜合評價(jià)大鼠的行為狀態(tài)。抑郁評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):SPT中糖水消耗百分比減少30%以上且在FST中的不動時(shí)間增加超過50%的大鼠為抑郁大鼠。1)120只2月齡雄性SD大鼠(200g±20g)隨機(jī)分為對照組(n=25,CON)和CUS組(n=95)。造模21天后,CUS組38只大鼠表現(xiàn)出明顯抑郁行為。隨機(jī)選取其中15只抑郁大鼠,給予7天的Morris水迷宮訓(xùn)練,為抑郁后學(xué)習(xí)組(D-L);同時(shí)選取15只抑郁大鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練(每天的游泳時(shí)間與D-L組的平均延遲時(shí)間相同),為抑郁后游泳組(D-S)。7天后進(jìn)行行為學(xué)檢測及其它分析。2)miR-191研究:84只SD大鼠隨機(jī)分為CUS組(n=60)及未應(yīng)激對照組(n=24),CUS組大鼠應(yīng)激一周后,采用SPT篩選出具有抑郁傾向的大鼠26只(連續(xù)2天SPT中糖水消耗比例65%定義為抑郁傾向)。將抑郁傾向大鼠隨機(jī)分為兩組:一組大鼠進(jìn)行雙側(cè)海馬CA3區(qū)注射miR191激動劑Agomir-miR191(n=15,CUS+Agomir-miR191),一組大鼠進(jìn)行雙側(cè)海馬CA3區(qū)注射PBS對照(n=11,CUS+PBS);海馬注射后繼續(xù)應(yīng)激2周。同時(shí)將未應(yīng)激大鼠隨機(jī)分為兩組:一組大鼠進(jìn)行雙側(cè)海馬CA3區(qū)注射miR191拮抗劑Antagomir-miR191(n=12,Antagomir-miR191),一組大鼠進(jìn)行雙側(cè)海馬CA3區(qū)注射PBS對照(n=12,PBS);同步喂養(yǎng)2周。處理結(jié)束后將上述4組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測及其它分析。相關(guān)檢測:采用基于同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),檢測并篩選出各組大鼠海馬組織差異表達(dá)蛋白。還采用了免疫印跡、免疫熒光、免疫組織化學(xué)和定量PCR等技術(shù)。結(jié)果1.空間學(xué)習(xí)改善CUS誘導(dǎo)的大鼠抑郁行為95只CUS大鼠中,38只于21天后表現(xiàn)出明顯抑郁行為。具體表現(xiàn)為:在OFT中的穿越格子數(shù)、雙上肢上抬次數(shù)和運(yùn)動距離明顯減少,在FST中的靜止時(shí)間從65 s延長為114 s,SPT顯示其糖水消耗百分比從84%降低至52%。Morris水迷宮學(xué)習(xí)7天后,D-L大鼠在OFT中的穿越格子數(shù)、雙上肢上抬次數(shù)和運(yùn)動距離顯著增加,在FST中的靜止時(shí)間減少至43 s,在SPT中的糖水消耗百分比為72%;而D-S大鼠在OFT中的穿越格子數(shù)、雙上肢上抬次數(shù)和運(yùn)動距離依舊低于CON大鼠,在FST中的靜止時(shí)間為92 s,在SPT中的糖水消耗百分比為45%。綜上說明,空間學(xué)習(xí)可顯著改善CUS誘導(dǎo)的大鼠抑郁行為。2.空間學(xué)習(xí)提高突觸相關(guān)蛋白的水平、提高少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白的水平及調(diào)節(jié)蛋白激酶和蛋白磷酸酶的異常蛋白組學(xué)分析:分析CON、D-S和D-L三組大鼠(n=3)的海馬差異蛋白。共鑒定出4756個(gè)蛋白,定量了3482個(gè)蛋白。其中,在D-S/CON中有11種上調(diào)蛋白和11種下調(diào)蛋白;在D-L/CON中有42種上調(diào)蛋白和11種下調(diào)蛋白;在D-L/D-S中有26種上調(diào)蛋白和8種下調(diào)蛋白。生物信息學(xué)分析的結(jié)果顯示:G蛋白偶聯(lián)谷氨酸受體信號通路、谷氨酸釋放、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白激酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、蛋白激酶B信號通路和微管聚合或解聚等通路發(fā)生了改變。同時(shí),多個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白的水平也發(fā)生了變化。免疫印跡結(jié)果顯示,D-L大鼠的SNAP25和PSD95水平顯著高于D-S大鼠32%和53%,達(dá)到CON大鼠的水平;D-L大鼠相較D-S大鼠的NR1、GluR1和GluR2水平增加了33%、55%和57%;D-L大鼠NR2B的水平比CON大鼠增加了45%,比D-S大鼠增加了45%。D-L大鼠PLP1水平比CON大鼠增加了48%;與D-S大鼠相比,D-L大鼠MAG增加了22%,PLP1增加了85%。D-L大鼠PKAα的水平顯著降低,比CON大鼠降低了44%,比D-S大鼠降低了41%;D-S大鼠和D-L大鼠海馬中的GSK-3β水平分別比CON大鼠增加了169%和119%;D-S大鼠PP2Ac水平比CON大鼠增加了42%;D-L大鼠PP2A-Y307與CON大鼠和D-S大鼠相比,分別下降了34%和33%;D-L大鼠的PPP1A水平比CON大鼠和D-S大鼠分別下降48%和42%。3.抑郁大鼠的海馬神經(jīng)元數(shù)量減少、凋亡水平增加尼氏染色結(jié)果顯示,抑郁大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量相較對照組大鼠分別下降20%、29%和22%。免疫印跡結(jié)果顯示,與對照組相比,抑郁大鼠海馬死亡相關(guān)蛋白激酶1(Death-associated protein kinase 1,DAPK1)增加48%,Caspase 3增加32%,Cleaved caspase 3增加50%,Beclin1增加33%,LC3II/I比值增加53%,提示凋亡和自噬水平上升。在體外模擬神經(jīng)元CUS暴露:10~-44 M糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元24 h后,與對照神經(jīng)元相比,DAPK1增加62%,Caspase 3增加83%,Cleaved caspase 3增加53%,Beclin1增加36%,LC3 II/I比值增加35%。4.空間學(xué)習(xí)降低抑郁大鼠海馬DAPK1水平、增加miR-191水平與CON大鼠相比,D-S大鼠海馬DAPK1增加41%,Cleaved caspase 3增加52%,Beclin1增加54%,LC3 II/I比值增加59%。D-L大鼠比D-S大鼠的DAPK1減少26%,Cleaved caspase 3減少36%,Beclin1減少41%,但LC3 II/I比值仍高于對照組40%。定量PCR結(jié)果顯示,D-S大鼠miR-191水平顯著低于CON大鼠45%,D-L大鼠海馬miR-191水平較D-S大鼠上升了131%,與CON大鼠無差異。5.上調(diào)miR-191水平改善慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠抑郁行為為研究miR-191與DAPK1變化的關(guān)系,在培養(yǎng)的N2a細(xì)胞中下調(diào)miR-191水平后,DAPK1增加52%,Caspase 3增加44%,Cleaved caspase 3增加31%,Beclin1增加45%,LC3 II/I比值增加78%。說明miR-191下調(diào)可誘導(dǎo)DAPK1上調(diào)。同時(shí),雙熒光素酶結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-191與DAPK1的直接靶向關(guān)系。Antagomir-miR191大鼠在OFT中的穿越格子數(shù)、雙上肢上抬次數(shù)和運(yùn)動距離較PBS大鼠分別下降44%、55%和46%;在FST中的靜止時(shí)間為113 s;在SPT中的糖水消耗百分減少了29%。CUS+Agomir-miR191大鼠在OFT中的穿越格子數(shù)和運(yùn)動距離較CUS+PBS組分別增加94%和96%;在FST的靜止時(shí)間從125 s下降至70 s;在SPT中的糖水消耗百分比增加了55%。與PBS大鼠相比,Antagomir-miR191大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量分別下降21%、25%和34%;DAPK1增加40%,Caspase 3增加54%,Cleaved caspase 3增加68%,Beclin1增加47%,LC3 II/I比值增加27%。與CUS+PBS大鼠相比,CUS+Agomir-miR191大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量分別增加35%、35%和38%;DAPK1降低24%,Caspase 3降低32%,Cleaved caspase 3降低31%,Beclin1降低26%,LC3 II/I比值降低17%。結(jié)論空間學(xué)習(xí)能通過上調(diào)抑郁大鼠海馬miR-191水平,靶向下調(diào)DAPK1水平,減少海馬神經(jīng)元的丟失,從而改善CUS誘導(dǎo)的大鼠抑郁行為。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R749.4

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