發(fā)布時(shí)間：2020-03-24 21:50

【摘要】：γ-氨基丁酸A型受體(GABAA受體)是一種配體門控氯離子通道,是由多個(gè)亞基裝配而成的五聚體,它介導(dǎo)了腦內(nèi)大多數(shù)抑制性神經(jīng)傳遞的過程,并且它還是鎮(zhèn)靜催眠類藥物包括酒精在內(nèi)的主要靶點(diǎn)。酒精可以變構(gòu)地增強(qiáng)GABAA受體的功能[1,2],而慢性酒精激活則可能導(dǎo)致GABAA受體出現(xiàn)可塑性變化,產(chǎn)生酒精耐受,酒精依賴以及酒精戒斷綜合征(AWS)。突觸外含δ亞基的GABAA受體(δ-GABAA受體)對(duì)GABA有高親和力和低效力,脫敏緩慢,對(duì)苯二氮卓類藥物不敏感,以及在表達(dá)α4βδ受體的不同系統(tǒng)中對(duì)酒精均表現(xiàn)出高敏感性。研究發(fā)現(xiàn)突觸外δ-GABAA受體內(nèi)化可能是酒精引起GABAA受體可塑性改變的“導(dǎo)火索”,PKC介導(dǎo)的受體磷酸化可能參與酒精調(diào)節(jié)GABAA受體可塑性改變,但是具體機(jī)制和可能參與的PKC亞型尚待闡明。本實(shí)驗(yàn)在體外原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中,采用電生理、蛋白生化、分子生物學(xué)和熒光成像等技術(shù),研究單次劑量酒精撤退引起突觸外δ-GABAA受體快速內(nèi)化的調(diào)節(jié)機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn),在單次劑量酒精(60 mM,30分鐘)或okadaicacid(100nM,30分鐘)預(yù)處理/撤退后30分鐘,培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突觸外δ-GABAA受體介導(dǎo)的緊張性抑制電流(tonic current,Itonic)幅度明顯減小,急性酒精對(duì)Itonic的增強(qiáng)作用也顯著降低,即Itonic急性酒精耐受,提示蛋白磷酸化可能參與了單次劑量酒精撤退誘導(dǎo)的突觸外δ-GABAA受體功能的降低。應(yīng)用PKC抑制劑chelerythrine chloride(10 μM)處理可以明顯挽救單次劑量酒精撤退引起的Itonic幅度下降和急性酒精耐受,但是PKA抑制劑H89(20 μM)處理則沒有明顯作用。此外,PKC激動(dòng)劑佛波酯(100 nM)處理可引起與單次劑量酒精或okadaic acid處理后相似的Itonic幅度下降和急性酒精耐受,而PKA激動(dòng)劑forskolin(10 μM)則沒有作用,這提示我們PKC而非PKA介導(dǎo)的受體磷酸化參與了單次劑量酒精撤退誘導(dǎo)的突觸外δ-GABAA受體的迅速內(nèi)化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制PKC可以阻斷單次劑量酒精撤退引起的GABAA受體δ亞基膜表面表達(dá)的降低和重組GABAA受體δ亞基熒光強(qiáng)度的下降,進(jìn)一步支持PKC可能參與酒精撤退對(duì)δ-GABAA受體的快速調(diào)控。Western blot結(jié)果顯示單次劑量酒精撤退能夠選擇性地增加PKCδ而非PKCγ和PKCε的表達(dá)。選擇性抑制PKCδ亞型不僅能夠阻斷單次劑量酒精撤退引起GABAA受體δ亞基膜表面表達(dá)的降低,而且也能挽救Itonic急性酒精耐受以及重組GABAA受體δ亞基熒光強(qiáng)度的下降。這些結(jié)果顯示PKCδ亞型參與酒精撤退對(duì)突觸外δ-GABAA受體的快速調(diào)控。以上結(jié)果說明,PKCδ介導(dǎo)的受體磷酸化在單次劑量酒精撤退對(duì)突觸外GABAA受體δ亞基迅速內(nèi)化的調(diào)控中起重要作用。PKCδ的活化很可能是酒精撤退引起GABAA受體可塑性改變的重要基礎(chǔ)。這一發(fā)現(xiàn)可以為酒精耐受,酒精依賴以及AWS發(fā)病的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制提供新的科學(xué)證據(jù),以及臨床治療的新思路。
【圖文】：

圖３．１．１邋Ｏｋａｄａｉｃ邋ａｃｉｄ可以部分模擬酒精撤遐誘導(dǎo)的突觸外ＧＡＢＡａ受體介導(dǎo)的緊張性電流（Ｉｔｒａｉｅ）逡逑幅度的減小和Ｉｔｔｍｉ。急性酒精耐受。圖Ａ，對(duì)照（Ｃｔｒｌ）、酒精（Ｅ）和ｏｋａｄａｉｃ邋ａｃｉｄ邋（ＯＡ）預(yù)暴逡逑露撤逗３０分鐘后記錄的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元Ｉｔａｎｉ。典型圖。記錄電流時(shí)的鉗制電壓為－７０ｍＶ，接著應(yīng)逡逑用ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ（ｂｉｃ，１０（ｉＭ），應(yīng)用前后的ＩｈＱｌｄ用虛線表示以顯示出ＩｔＱｎｉｅ幅度（基線為從左邊開逡逑始的綠線；應(yīng)用ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ顯示為開始于最右端附近的綠線）。圖Ｂ，如圖Ａ所示，各處理組藥逡逑物撤退３０分鐘時(shí)記錄的神經(jīng)元Ｉｔｔｍｉｅ幅度的變化。圖Ｃ和Ｄ，如圖Ｂ所示，各組神經(jīng)元中ｍＩＰＳＣ的逡逑總電荷轉(zhuǎn)移（ｍＩＰＳＣ面積，圖Ｃ）和ｍＩＰＳＣ頻率（圖Ｄ）的變化。圖Ｅ，如圖Ａ所示的來自不逡逑同處理組的神經(jīng)元，急性酒精（６０ｍＭ）處理之后應(yīng)用ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ記錄的電生理典型圖。急性逡逑酒精應(yīng)用后的ＩＭｄ用粉紅色虛線表示。圖Ｆ，圖Ｅ記錄的急性酒精處理對(duì)Ｉｔｃｍｋ幅度的影響。每組ｎ逡逑為１２－１５個(gè)細(xì)胞。與對(duì)照組神經(jīng)元相比，戶＜邋０．０１邋（單因素方差分析）；與對(duì)照組神經(jīng)元相比，逡逑＊Ｐ＜邋０．００１邋（雙因素方差分析）；與急性酒精處理前相比，佑＜0．0１邋（雙因素方差分析）。數(shù)逡逑據(jù)表示為Ｍｅａｎ士邋ＳＥＭ。逡逑

１１Ｍ）來確定在沒有酒精作用情況下，機(jī)體內(nèi)ＰＫＣ激活是否具有相似的作用。結(jié)果逡逑顯示，，ＰＤＢｕ預(yù)暴露（Ｐ組）可以導(dǎo)致Ｉｔｏｎｉｃ幅度的減小以及Ｉｔ＿急性酒精耐受（圖逡逑３．２．１Ｂ和表１），這與在ＯＡ處理組中觀察到的結(jié)果相似（圖３．１．１Ｆ），但ＰＫＡ激逡逑動(dòng)劑ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ邋（Ｆ，邋１０邋ｎＭ）單獨(dú)處理則沒有相似作用（圖３．２．１邋Ｂ和表１），表明逡逑ＰＫＣ激活而非ＰＫＡ激活參與了單次劑量酒精撤退對(duì)突觸外Ｓ－ＧＡＢＡａ受體功能的逡逑快速調(diào)節(jié)。逡逑八邐Ａｃｕｔｅ邋ｅｔｈａｎｏｌ邋６０邋ｍＭ邋邐ｂｉｃ邐Ｂ逡逑ｎｔＨ邐邐邋 NB邋■…一邐－邐４０］令邋Ｃｔｒｌ邐ｈ＋Ｅ邋十逡逑Ｃｔｆ１邐邐Ｚ９Ｊ１Ｌ邐？Ｅ＂Ｔ＿Ｆｉ邋＋逡逑ｒＴＰｐｍ邐丨喊邐３。逡逑Ｅ邋ｉＴｒｐ＾Ｔｒｒｒｒｆｒｒｒｆ：：＾＾＂＾：邋［１：邋５２。逡逑————邋－邐１邋ｏ逡逑＾ＴＴＴ＾邋＾ｒｆ＾ｆｗ５邐°邋0邐＾逡逑Ｉ邐［Ａｃｕｔｅ邋ｅｔｈａｎｏｌ］邋（ｍＭ）逡逑Ｈ＋Ｅ邐邐邋：二：逡逑圖３．２．１抑制ＰＫＣ作用可阻斷單次劑量酒精撤退誘導(dǎo)的Ｉｔｏｎｉｅ幅度的減小和急性酒精耐受。圖Ａ，逡逑對(duì)照（Ｃｔｒｌ），酒精（Ｅ），邋ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅｃｈｌｏｒｉｄｅ邋加酒精（Ｃ＋Ｅ）和邋Ｈ－８９邋加酒精（Ｈ＋Ｅ）撤退邋３０逡逑分鐘后記錄的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元Ｉｔｃｍｉｅ典型圖。圖Ｂ，對(duì)照（Ｃｔｒｌ），酒精（Ｅ），邋ｃｈｅｌｅｒｙｔｈｒｉｎｅｃｈｌｏｒｉｄｅ逡逑加酒精（Ｃ＋Ｅ）
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.62

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本文編號(hào)：2598908