【摘要】：阿片類物質(zhì)能產(chǎn)生強效的鎮(zhèn)痛作用,但同時也是一種具有濫用潛質(zhì)的藥物,長期使用將導(dǎo)致耐受和依賴等副作用。阿片類藥物濫用使個體健康水平下降,社會犯罪率上升,給社會安定帶來巨大的威脅,是法醫(yī)毒理學(xué)重要的研究內(nèi)容。我國當(dāng)前的毒品濫用形勢非常嚴(yán)峻,開發(fā)有效的戒毒藥物具有深刻的現(xiàn)實意義和社會價值。 阿片依賴是一種慢性復(fù)發(fā)性腦病,以強迫用藥、不斷增加藥物攝入量和停藥時出現(xiàn)戒斷綜合征為主要特征,其發(fā)生的確切機制還不清楚。最近研究認(rèn)為,許多非阿片受體作用系統(tǒng)可能是阿片依賴防治中的重要靶點。膽囊收縮素(Cholecystokinin, CCK)是一種典型的神經(jīng)肽,廣泛存在于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。其中,八肽膽囊收縮素(Cholecystokinin octopeptide,CCK-8)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的存在形式,是迄今體內(nèi)最強的抗阿片肽類物質(zhì)。研究顯示,CCK-8可以阻止阿片肽與其受體的結(jié)合；嗎啡或內(nèi)源性腦啡肽能使K+誘發(fā)的大鼠中樞黑質(zhì)的CCK釋放呈“負(fù)反饋”性增加；CCK受體拮抗劑可以有效的防治反復(fù)嗎啡處理或電針鎮(zhèn)痛引起的耐受。除了上述的抗阿片效應(yīng)之外,CCK作為一種神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì),還可調(diào)節(jié)鎮(zhèn)痛、認(rèn)知、獎賞、學(xué)習(xí)和記憶等過程。CCK及CCK受體mRNA在藥物獎賞效應(yīng)相關(guān)的腦區(qū)均有分布,如額葉皮質(zhì)、杏仁核、腹側(cè)被蓋區(qū)、伏隔核�；谝陨咸攸c,我們推斷CCK系統(tǒng)可能參與藥物獎賞過程。Mitchell等通過條件性位置偏愛實驗(conditioned place preference, CPP)考察了CCK受體拮抗劑對嗎啡獎賞效應(yīng)的影響,并認(rèn)為內(nèi)源性CCK是嗎啡誘導(dǎo)CPP表達(dá)的必要條件。還有研究發(fā)現(xiàn)CCK受體拮抗劑能抑制嗎啡依賴的形成、減輕戒斷癥狀,阻斷可卡因和嗎啡誘導(dǎo)的CPP表達(dá)及復(fù)吸。因此,內(nèi)源性CCK系統(tǒng)在阿片類藥物依賴過程中具有重要作用。 有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)皮下注射嗎啡前給予外源性CCK-8慢性干預(yù)也可減輕納洛酮引起的急性催促戒斷癥狀,與CCK受體拮抗劑的作用一致。也有研究曾報道,激活CCK受體可以抑制嗎啡耐受。上述結(jié)果提示外源性CCK-8的干預(yù)作用可能與內(nèi)源性CCK并不相同,其作用機制尚不清楚。我們考慮這種矛盾的現(xiàn)象可能與CCK-8的量效關(guān)系以及CCK受體敏感性有關(guān)。另外,阿片依賴牽涉阿片受體、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子通道、神經(jīng)核團與神經(jīng)回路、學(xué)習(xí)記憶和獎賞機制等許多方面。神經(jīng)遞質(zhì)在藥物成癮過程中發(fā)揮了重要作用,是藥物依賴及其戒斷過程最根本的神經(jīng)生物學(xué)機制之一。但是,有關(guān)CCK-8與神經(jīng)遞質(zhì)之間的聯(lián)系目前尚不明確,其在成癮行為形成的長時程適應(yīng)過程中的互相調(diào)節(jié)機制還需進一步研究。 基于以上研究背景,本研究通過觀察CCK-8對嗎啡依賴細(xì)胞模型以及嗎啡誘導(dǎo)的CPP動物模型的影響,從體外細(xì)胞水平及動物整體水平明確不同劑量的CCK-8對嗎啡依賴和復(fù)吸的作用,并從CCK與阿片系統(tǒng)相互作用關(guān)系和神經(jīng)化學(xué)方面進一步探討其相關(guān)作用機制,為CCK-8在嗎啡依賴防治方面的實際應(yīng)用提供系統(tǒng)、可靠的理論依據(jù)。1外源性CCK-8對嗎啡精神依賴及復(fù)吸大鼠的影響 目的：通過建立條件性位置偏愛(CPP)實驗?zāi)Ｐ?觀察不同劑量的外源性CCK-8對嗎啡誘導(dǎo)的CPP獲得、表達(dá)、消退的作用,以評價外源性CCK-8對嗎啡精神依賴的影響；并通過觀察不同劑量CCK-8對CPP重燃及行為敏化的作用,評價外源性CCK-8對復(fù)吸過程的影響。 方法：給予皮下注射10mg/kg嗎啡或側(cè)腦室注射不同劑量(0.01、0.1、1μg)的CCK-8后進行程序性訓(xùn)練7天,建立大鼠CPP實驗?zāi)Ｐ?無偏設(shè)計),并觀察嗎啡及CCK-8本身是否能誘導(dǎo)CPP形成。然后,在皮下注射嗎啡前給予側(cè)腦室注射不同劑量的CCK-8(0.01、0.1、1μg)干預(yù),觀察CCK-8對CPP形成的影響；CPP表達(dá)測試前15min給予大鼠側(cè)腦室注射不同劑量CCK-8(0.01、0.1、1μg)干預(yù),且于CPP測試后自然消退10天,觀察其對CPP的表達(dá)及消退的影響。為觀察CCK-8對復(fù)吸過程的影響,在建立大鼠CPP模型后,自然熄滅10天,以皮下注射3mg/kg嗎啡進行CPP重燃,并于重燃前側(cè)腦室注射CCK-8(0.01、0.1、1μg),再次進行CPP測試。為觀察CCK-8對行為敏化的影響,給予皮下注射10mg/kg嗎啡7天,并自然消退10天,然后皮下注射3mg/kg嗎啡激發(fā),測試大鼠30min內(nèi)運動總路程,建立大鼠行為敏化模型；并在表達(dá)期注射嗎啡前15min各組大鼠分別給予側(cè)腦室注射不同劑量CCK-8(0.01、0.1、1μg)觀察其對行為敏化表達(dá)的干預(yù)作用。最后,側(cè)腦室注射不同劑量CCK-8(0.01、0.1、1μg)后,測試大鼠30min內(nèi)運動總路程,觀察CCK-8對大鼠自發(fā)活動的影響。 結(jié)果：①單獨給予CCK-8(0.01、0.1、1μg, i.c.v.)不能誘導(dǎo)CPP,也不產(chǎn)生位置厭惡；②皮下注射嗎啡(10mg/kg)前于側(cè)腦室注射不同劑量的CCK-8(0.01、0.1、1μg)進行干預(yù),能顯著抑制嗎啡誘導(dǎo)的CPP的形成,CPP得分顯著降低；③1μg CCK-8可促進CPP的表達(dá),使CPP得分顯著增加,0.01、0.1μg CCK-8對CPP表達(dá)無明顯影響；0.1與1μgCCK-8能明顯抑制CPP的消退,而0.01μg CCK-8對CPP消退無明顯影響；④皮下注射3mg/kg嗎啡成功誘導(dǎo)CPP的重燃,并且1μg和0.1μgCCK-8有效抑制了小劑量嗎啡重燃CPP的過程,0.01μg CCK-8對CPP重燃無明顯影響；⑤0.1與1μg CCK-8可顯著抑制行為敏化的表達(dá),但0.01CCK-8對嗎啡誘導(dǎo)的行為敏化過程無明顯影響；⑥側(cè)腦室注射1μgCCK-8可抑制大鼠的自發(fā)活動,30min內(nèi)活動總路程明顯降低。 小結(jié)：本部分實驗成功建立了大鼠CPP實驗?zāi)Ｐ?并首次發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室給予不同劑量的CCK-8(0.01、0.1、1μg)可抑制嗎啡誘導(dǎo)大鼠CPP的形成。同時,還發(fā)現(xiàn)CCK-8(0.1、1μg)可以抑制小劑量嗎啡引起的CPP重燃；抑制嗎啡誘導(dǎo)行為敏化的形成,提示外源性CCK-8對嗎啡精神依賴及復(fù)吸過程均有顯著的調(diào)節(jié)作用。2外源性CCK-8對SH-SY5Y細(xì)胞慢性嗎啡依賴的影響及其相關(guān)受體機制 目的：觀察外源性CCK-8對嗎啡依賴SH-SY5Y細(xì)胞模型的影響,并探討外源性CCK-8作用的量效關(guān)系以及與CCK受體敏感性的關(guān)系。 方法：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)μ阿片受體、CCK1受體、CCK2受體及內(nèi)源性CCK的表達(dá),確定SH-SY5Y細(xì)胞是否符合細(xì)胞模型建立的要求。用10μM嗎啡作用于全反式維甲酸(retinoic acid, RA)分化6d的SH-SY5Y細(xì)胞48h,建立細(xì)胞嗎啡依賴模型,并用10μM納洛酮作用15min進行急性催促戒斷,誘導(dǎo)"cAMP超射”,并以cAMP超射水平為評價指標(biāo),觀察不同濃度的CCK-8及選擇性CCK1/2受體拮抗劑對細(xì)胞嗎啡依賴的影響。 結(jié)果：①μ阿片受體、CCK1受體、CCK2受體及內(nèi)源性CCK均在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)共同表達(dá),可用于細(xì)胞模型的建立；②用10μM嗎啡作用于RA分化6d的SH-SY5Y細(xì)胞48h后,cAMP含量明顯增加,給予10μM納洛酮催促戒斷15min后,使SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)cAMP含量進一步增加3.09±0.28倍,形成明顯的cAMP超射狀態(tài),說明慢性嗎啡依賴細(xì)胞模型建立成功。并且,慢性嗎啡處理使CCK受體及內(nèi)源性CCK表達(dá)顯著上調(diào)；③1-10μM CCK2受體拮抗劑(LY-288,513)顯著抑制了納洛酮催促戒斷引起的cAMP超射,而CCK1受體拮抗劑(L-364,718)對其無明顯作用；④CCK受體激動劑CCK-8(0.1-1μM)與嗎啡共同孵育細(xì)胞能濃度依賴性的抑制納洛酮催促戒斷引起的cAMP超射,并且這種作用可被CCK1受體拮抗劑翻轉(zhuǎn)。因此,內(nèi)源性CCK通過CCK2受體促進嗎啡依賴的形成,而外源性大劑量CCK-8對嗎啡依賴的抑制作用可能與CCK1受體有關(guān)。 小結(jié)：本部分實驗結(jié)果提示外源性CCK-8和內(nèi)源性CCK對嗎啡依賴過程的作用不同,且首次發(fā)現(xiàn)CCK1受體參與了外源性CCK-8抑制嗎啡依賴的過程。 3CCK-8對內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用 目的：通過觀察不同濃度的CCK-8對嗎啡依賴SH-SY5Y細(xì)胞模型內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的影響,初步探討CCK-8與內(nèi)源性阿片系統(tǒng)在嗎啡依賴過程的相互作用及其機制。 方法：提取大鼠腦組織及SH-SY5Y細(xì)胞膜蛋白,應(yīng)用放射配基結(jié)合技術(shù)觀察不同濃度CCK-8對μ阿片受體(MOR)結(jié)合特征的影響。應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測SH-SY5Y細(xì)胞前腦啡肽原(PENK)、前阿黑皮質(zhì)素原(POMC)基因的表達(dá),觀察不同濃度CCK-8對PENK、POMC表達(dá)的影響。建立嗎啡慢性依賴SH-SY5Y細(xì)胞模型,檢測CCK受體、內(nèi)源性CCK以及內(nèi)源性阿片肽原PENK、POMC表達(dá)的變化,并觀察不同濃度CCK-8對嗎啡處理后PENK、POMC表達(dá)變化的影響。 結(jié)果：①大鼠腦組織μ阿片受體的Bmax值為82.9±7.2pmol·mg-1Pro, Kd值為1.38±0.05。CCK-8可以濃度依賴性地抑制大鼠腦組織中μ阿片受體與其配基[3H]DAMGO的結(jié)合,并可濃度依賴性的降低μ阿片受體結(jié)合反應(yīng)的Bmax值,而對Kd值無明顯影響；②RA分化6d后的SH-SY5Y細(xì)胞μ阿片受體的Bmax值為378.3±48.9pmol·mg-1Pro,Kd值為0.79±0.09。CCK-8可濃度依賴性地抑制SH-SY5Y細(xì)胞μ阿片受體與其配基[3H]DAMGO的結(jié)合,并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受體拮抗劑(L-364,718,LY-288,513)翻轉(zhuǎn)；③10μM嗎啡作用于RA分化SH-SY5Y細(xì)胞48h后,內(nèi)源性CCK系統(tǒng)明顯上調(diào),CCK1受體、CCK2受體及內(nèi)源性CCK mRNA表達(dá)水平分別增加2.51±0.56、6.10±0.91和4.87±1.08倍；④10-10M-10-6M CCK-8孵育RA分化6d后的SH-SY5Y細(xì)胞48h后,結(jié)果顯示10-7M、10-6M時可使PENK、POMC表達(dá)顯著上調(diào),并且這種作用可被CCK1受體拮抗劑L364,718翻轉(zhuǎn)；⑤10μM嗎啡處理RA分化6d的SH-SY5Y細(xì)胞48h后,PENK、POMC表達(dá)較正常組均明顯下調(diào),并且10-8、10-7、10-6MCCK-8與嗎啡共同孵育可使PENK、POMC表達(dá)較嗎啡組顯著增加。小結(jié)：①低濃度(10-10、10-9M)CCK-8可通過激活CCK受體抑制SH-SY5Y細(xì)胞μ阿片受體的結(jié)合力,對PENK、POMC的表達(dá)無明顯影響；②高濃度(10-8-10-6M)的CCK-8可使PENK、POMC基因表達(dá)增加,促進內(nèi)源性阿片肽的釋放,并可改善嗎啡依賴后內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的失衡。 4CCK-8對SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清中單胺類及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響 目的：通過高效液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)技術(shù)檢測SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清中DA、5-HT、NE、谷氨酸和GABA及其代謝產(chǎn)物的含量,并觀察嗎啡及CCK-8急性處理對培養(yǎng)上清中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響,進一步闡明CCK-8調(diào)節(jié)嗎啡成癮過程的神經(jīng)化學(xué)機制。 方法：培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,RA分化6d后更換為HBSS緩沖液孵育細(xì)胞,24h后加入相應(yīng)的藥物進行刺激,然后分別于10、20、40、60min各取出100μl上清液,樣品處理后應(yīng)用LC-MS檢測DA、DOPAC、HVA、5-HT、5-HIAA、NE、MHPG、Glu、GABA九種神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量,觀察嗎啡及CCK-8急性處理對培養(yǎng)上清中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響。結(jié)果：①給予100μM嗎啡孵育RA分化后SH-SY5Y細(xì)胞,分別于10、20、40、60min取出部分上清液進行LC-MS檢測,結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、NE和5-HT及其代謝產(chǎn)物在10-20min內(nèi)均顯著下降,隨后逐漸降低并保持在較低水平。同時,興奮性氨基酸 (Glu)的釋放也明顯減少,而抑制性氨基酸(GABA)釋放增加。表明激活阿片受體對神經(jīng)元產(chǎn)生的直接作用是抑制性的；②給予100μM嗎啡與10-6M CCK-8共同孵育細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清中DA、NE、5-HT、Glu及其代謝產(chǎn)物的含量在10-60min內(nèi)呈下降趨勢,但是明顯高于單獨嗎啡處理細(xì)胞上清液中的遞質(zhì)水平；GABA含量也有所上升,但明顯低于單獨嗎啡處理細(xì)胞。說明CCK-8可以有效拮抗急性嗎啡處理對細(xì)胞產(chǎn)生的抑制作用；③單獨給予CCK-8急性處理SH-SY5Y細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCK-8使細(xì)胞培養(yǎng)上清中DA及其代謝產(chǎn)物的含量降低,在20min左右時達(dá)最低水平,隨后逐漸升高；并且CCK-8急性處理后,GABA含量升高、Glu含量降低,而NE、5-HT及其代謝產(chǎn)物的含量無明顯變化。 小結(jié)：本部分實驗結(jié)果顯示急性嗎啡或CCK-8單獨處理對SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生的直接作用是抑制性的,體現(xiàn)在兩者可抑制單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(DA、NE、5-HT)及興奮性氨基酸(Glu)的釋放,增強抑制性氨基酸(GABA)釋放；而CCK-8可拮抗嗎啡急性處理產(chǎn)生的抑制作用,說明CCK-8可通過受體間的相互作用在神經(jīng)遞質(zhì)水平發(fā)揮其“抗阿片”作用。 結(jié)論：本文在細(xì)胞及動物整體水平系統(tǒng)研究了外源性CCK-8對嗎啡依賴及復(fù)吸過程的作用,并探討了CCK-8作用的相關(guān)受體及神經(jīng)化學(xué)機制,觀察了CCK-8與內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。得出以下結(jié)論： 1側(cè)腦室給予CCK-8(0.01、0.1、1μg)干預(yù)可抑制嗎啡誘導(dǎo)大鼠CPP的形成。同時,還發(fā)現(xiàn)CCK-8(0.1、1μg)可以抑制小劑量嗎啡引起的CPP重燃、抑制嗎啡誘導(dǎo)行為敏化的形成,提示外源性CCK-8對嗎啡精神依賴及復(fù)吸過程均有顯著的調(diào)節(jié)作用； 2外源性CCK-8和內(nèi)源性CCK對嗎啡依賴過程的作用并不相同,內(nèi)源性CCK通過CCK2受體促進嗎啡依賴的形成,而外源性高濃度CCK-8通過CCK1受體發(fā)揮其抑制作用； 3低濃度(10-10、10-9M)CCK-8可通過激活CCK受體抑制μ阿片受體的結(jié)合力,但對PENK、POMC的表達(dá)無明顯影響；高濃度(10-8、10-7、10-6M)的CCK-8可使PENK、POMC基因表達(dá)增加,促進內(nèi)源性阿片肽的釋放,并可改善嗎啡依賴后內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的失衡； 4急性嗎啡或CCK-8單獨處理對SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生的直接作用是抑制性的,體現(xiàn)在兩者可抑制單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(DA、NE、5-HT)及興奮性氨基酸(Glu)的釋放,增強抑制性氨基酸(GABA)釋放；而CCK-8可拮抗嗎啡急性處理產(chǎn)生的抑制作用,說明CCK-8可通過受體間的相互作用在神經(jīng)遞質(zhì)水平發(fā)揮其“抗阿片”作用。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R749.6

【參考文獻】

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本文編號：2365687