精神疾病和成癮性精神障礙已經(jīng)成為重要的公共衛(wèi)生和社會問題,雖然這類疾病的臨床表現(xiàn)各異,但中樞神經(jīng)遞質(zhì)的異常在這類疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都發(fā)揮著重要作用。 1957年瑞典科學(xué)家阿爾維德·卡爾森(Arvid Carlsson)首先將多巴胺(dopamine, DA)確定為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),廣泛參與學(xué)習(xí)記憶、運動、認知、情緒情感、行為動機和神經(jīng)內(nèi)分泌等多種生理功能的調(diào)節(jié)。多巴胺系統(tǒng)是近30年來神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點問題之一,許多神經(jīng)精神疾病如帕金森氏病(Parkinson's disease, PD)、精神分裂癥(Schizophrenia)、Tourette綜合征(Tourette syndrome, TS)、亨廷頓病、注意缺陷多動障礙(ADHD)、藥物成癮等均與多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞異常有關(guān)。中樞多巴胺能系統(tǒng)的信號傳遞取決于突觸間隙內(nèi)的多巴胺濃度,而位于中樞多巴胺能神經(jīng)元突觸前膜上的多巴胺轉(zhuǎn)運體(DA transporter, DAT)是調(diào)節(jié)和維持突觸間隙內(nèi)多巴胺濃度最重要的因子,是完成突觸前膜重攝取突觸間隙中多巴胺的物質(zhì)基礎(chǔ)。多巴胺轉(zhuǎn)運體屬于Na+、Cl-依賴性膜轉(zhuǎn)運體蛋白家族,它的主要功能是重攝取突觸間隙內(nèi)的多巴胺,從而調(diào)控突觸間隙內(nèi)多巴胺的有效濃度和維持多巴胺能神經(jīng)元間的信息傳遞。 近期發(fā)現(xiàn)多個與DAT相互作用的受體或蛋白能夠影響DAT的功能,如：多巴胺D2受體通過與DAT直接偶聯(lián)促進DAT招募到細胞膜上,增強DAT對多巴胺的重攝取功能；a-synuclein與DAT的羧基末端結(jié)合促進DAT的重攝取功能,增加多巴胺誘導(dǎo)的細胞凋亡；Parkin通過與DAT的羧基末端結(jié)合并干擾DAT與a-synuclein或D2R的結(jié)合,從而對多巴胺引起的細胞毒性起保護作用；羧肽酶E(CPE)與DAT結(jié)合,增強DAT的重攝取功能。 2007年英國研究小組和本實驗分別發(fā)現(xiàn)人類CUL4B基因的喪失功能突變導(dǎo)致一種X連鎖精神發(fā)育遲滯(X-linked mental retardation, XLMR)綜合征,患者主要表現(xiàn)為精神發(fā)育遲滯、癲癇、震顫、步態(tài)異常、共濟失調(diào)、失語、身材矮小和向心性肥胖等癥狀,該綜合征患者表現(xiàn)有多巴胺能神經(jīng)傳遞異常表型。 CUL4B屬于cullin基因家族,該家族成員是CULLIN-RING E3泛素連接酶復(fù)合體(CULLIN-RING ubiquitin Ligases, CRLs)的重要組成部分,主要發(fā)揮結(jié)構(gòu)支架作用。CRLs是目前已知的最大的一類泛素連接酶,該復(fù)合物識別并降解特異性的底物,參與調(diào)節(jié)包括細胞周期、細胞信號傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、生長發(fā)育以及DNA修復(fù)等幾乎所有的生命活動。 為研究CUL4B在多巴胺能神經(jīng)元中的作用及其機制,本課題首先采用Cre/LoxP系統(tǒng)建立了多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠模型,并對該小鼠模型進行了表型分析。本課題主要分為以下兩部分： 第一部分 多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠模型的建立 Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)的應(yīng)用標志著基因敲除技術(shù)進入了一個嶄新的時代,人們可以在特定組織、特定細胞和特定發(fā)育時期進行條件性基因敲除。實驗室前期采用條件性基因敲除策略,成功建立了Cul4b基因打靶小鼠即Cul4b floxed小鼠,然后利用該Cul4b floxed小鼠與不同類型的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,獲得Cul4b條件性基因敲除小鼠。實驗室首先利用EIIa-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Cul4b floxed小鼠交配獲得了Cul4b基因全身性敲除小鼠,發(fā)現(xiàn)Cul4b基因全身敲除導(dǎo)致小鼠在早期胚胎期死亡,提示CUL4B在個體發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。由于全身性敲除小鼠Cul4b基因?qū)е滦∈笈咛テ谥滤?限制了利用全身性敲除小鼠研究CUL4B功能。之后,實驗室又利用Nestin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Cul4b floxed基因打靶小鼠交配獲得了神經(jīng)系統(tǒng)特異性Cul4b敲除小鼠,發(fā)現(xiàn)該小鼠存在學(xué)習(xí)和記憶能力缺陷�；谝陨涎芯�,本課題利用Slc6a3-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Cul4b floxed基因打靶小鼠交配以獲得多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠模型。取得了以下結(jié)果： 1.采用兩輪交配的方式獲得多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠和對照小鼠：先將雌性Cul4bflox/flox小鼠與雄性Slc6a3-cre+/-轉(zhuǎn)基因小鼠交配,得到了多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠(Slc6a3-cre+/-;Cul4bflox/Y),然后再用得到的多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠(Slc6a3-cre+/-;Cul4bflox/Y)與雌性Cul4bflox/flox小鼠交配,所產(chǎn)生的子代中雌雄各有50%為基因敲除小鼠,采用PCR方法對小鼠的基因型進行了鑒定,證實預(yù)期結(jié)果。 2.為了確定該小鼠模型中Cul4b基因敲除的特異性和有效性,我們用免疫熒光方法對小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元進行TH和Cul4b免疫熒光雙染色,結(jié)果顯示,在中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元中未檢測到Cul4b蛋白的表達,說明多巴胺能神經(jīng)元中的Cul4b基因被成功敲除,小鼠模型建立成功。 第二部分 多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠的表型分析 通過上述交配策略可以得到多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠(Cul4bSlc6a3-Cre小鼠),并驗證了該小鼠的多巴胺能神經(jīng)元中的Cul4b基因被成功敲除,說明該小鼠模型建立成功。然后我們對該小鼠模型進行了表型分析,取得了以下研究結(jié)果： 1.首先利用HE染色分析了不同發(fā)育時期多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠和同窩對照小鼠的腦組織切片,結(jié)果顯示多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠的中腦和紋狀體區(qū)的組織結(jié)構(gòu)沒有明顯異常。 2.利用TH抗體對多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠的中腦腹側(cè)部位進行免疫組織化學(xué)染色和免疫組織熒光染色分析,結(jié)果顯示與同窩對照小鼠相比,多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠中腦腹側(cè)的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目、分布和形態(tài)沒有明顯差異。 3. TUNEL原位凋亡檢測結(jié)果顯示,多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠的中腦部位細胞凋亡沒有明顯變化。 4.我們利用免疫組織化學(xué)染色方法對多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠中腦黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)的DAT表達水平進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與同窩對照小鼠相比,敲除小鼠中腦黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)的DAT的表達水平?jīng)]有明顯變化。隨后我們又利用Western blotting實驗分析了敲除小鼠中腦黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)的TH和DAT的表達水平,也未檢測到這兩種蛋白的表達異常。 5.我們對多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠進行了長期觀察(1.5年),并未發(fā)現(xiàn)敲除小鼠存在明顯發(fā)育異常。利用Morris水迷宮、曠場實驗和轉(zhuǎn)棒實驗分析了多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠的行為學(xué)變化。Morris水迷宮證實,多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力與對照組小鼠相比沒有顯著差異。曠場實驗證實,多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠的自主運動能力與焦慮水平與對照組小鼠相比沒有明顯差異。轉(zhuǎn)棒實驗發(fā)現(xiàn)該小鼠的運動協(xié)調(diào)及抗疲勞能力亦沒有明顯變化。 綜上所述,本課題成功獲得了多巴胺能神經(jīng)元特異性Cul4b基因敲除小鼠。該敲除小鼠發(fā)育大體正常,組織學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)明顯異常,行為學(xué)分析也未發(fā)現(xiàn)明顯異常。初步分析顯示,敲除多巴胺能神經(jīng)元中的Cul4b基因并不影響小鼠的多巴胺能神經(jīng)傳遞。

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749;Q78
【目錄】：

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