發(fā)布時(shí)間：2018-07-14 14:36

【摘要】：酒精濫用一直是西方國(guó)家導(dǎo)致嚴(yán)重肝臟疾病的首要因素,在我國(guó),隨著人群中嗜酒者比例的不斷增長(zhǎng),酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因。酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)具體發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚,目前認(rèn)為ALD是在個(gè)體遺傳易感性基礎(chǔ)上,乙醇通過(guò)本身或其代謝產(chǎn)物乙醛的直接毒性、氧化應(yīng)激、免疫介導(dǎo)、細(xì)胞因子與內(nèi)毒素以及病毒疊加等機(jī)制引起肝細(xì)胞損傷。 我們前期通過(guò)建立慢性酒精性肝病大鼠模型,發(fā)現(xiàn)慢性酒精給予可引起大鼠原代肝細(xì)胞游離鈣離子濃度(cytoplasmic free Ca2+concentration,[Ca2+]i)顯著增加,線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondria permeability transition pore, MPTP)持續(xù)開(kāi)放、跨膜電位△Ψm下降,誘導(dǎo)肝細(xì)胞的損傷和/或凋亡,提示肝細(xì)胞鈣超載是乙醇誘導(dǎo)肝臟損傷的重要途徑。乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞[Ca2+]cyt升高的機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)乙醇可以通過(guò)抑制1,4,5-三磷酸肌醇受體(Inositol trisphosphate receptor, IP3R)降解途徑致其表達(dá)量增高,增強(qiáng)激素誘導(dǎo)的Ca2+自?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放；慢性乙醇給予后氧化應(yīng)激增強(qiáng),細(xì)胞膜通透性增加,膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能紊亂,使得胞外Ca2+內(nèi)流增多；同時(shí)乙醇可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞線(xiàn)粒體PTP呈高導(dǎo)性持續(xù)開(kāi)放,使線(xiàn)粒體Ca2+大量外流,加重肝細(xì)胞鈣超載。但是仍然存在以下問(wèn)題尚未解決：由IP3R引起的胞質(zhì)中Ca2+升高僅是一個(gè)瞬時(shí)變化,維持細(xì)胞鈣超載的持續(xù)性因素尚不清楚；乙醇誘導(dǎo)后胞膜哪些離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能紊亂介導(dǎo)了胞外Ca2+內(nèi)流仍不能確定；很多研究表明胞內(nèi)[Ca2+]cyt持續(xù)升高所致的線(xiàn)粒體Ca2+代償性蓄積,是線(xiàn)粒體PTP高導(dǎo)性開(kāi)放的重要原因,但前期胞內(nèi)[Ca2+]i升高的途徑仍未明確。鈣池操縱的Ca2+通道(store-operated Ca2+channels, SOCs)是包括肝細(xì)胞在內(nèi)的非興奮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的主要通道,在Ca2+參與的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著不可替代的作用。肝細(xì)胞中只有一種高Ca2+選擇性SOC,被ER內(nèi)腔Ca2+濃度降低激活而開(kāi)放,生理作用在于補(bǔ)充ER的Ca2+而避免鈣庫(kù)Ca2+耗竭。間質(zhì)相互作用因子1(stromal interaction molecule1, STIM1)及鈣釋放激活鈣通道蛋白1(Calcium release-activated calcium channel protein1, Orial)是目前已確定的肝細(xì)胞SOCs組成蛋白,STIM1為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度感受器,Orail是SOCs在細(xì)胞膜上的孔蛋白。 基于乙醇引起肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+的實(shí)驗(yàn)觀(guān)察及SOCs由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔Ca2+濃度下降激活的生物學(xué)特性,本研究提出以下假設(shè)：SOCs可能參與乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞鈣超載病理過(guò)程,其作用可能是在乙醇誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+瞬時(shí)釋放后,維持肝細(xì)胞胞外Ca2+持續(xù)內(nèi)流,從而使胞內(nèi)Ca2+濃度達(dá)到細(xì)胞損傷的程度。本研究通過(guò)建立體外乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞慢性損傷模型及體內(nèi)慢性ALD大鼠模型,利用通道阻斷劑鑒定SOCs在乙醇誘導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流及相關(guān)損傷中可能發(fā)揮的作用；檢測(cè)乙醇刺激對(duì)體內(nèi)外肝細(xì)胞SOCs通道蛋白分子STIM1、Orail表達(dá)量及定位的影響,并檢測(cè)SOCs通道蛋白STIM1、OrailRNA干擾對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞[Ca2+]i增高及相關(guān)損傷的影響,探討SOCs發(fā)揮作用的具體途徑。本研究分三個(gè)部分： 一、鈣池操縱鈣離子通道參與乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高及肝細(xì)胞損傷 目的 觀(guān)察體外乙醇慢性刺激對(duì)人HepG2細(xì)胞Ca2+濃度、細(xì)胞存活率及細(xì)胞損傷影響,通過(guò)EGTA、2-APB、La3+對(duì)上述過(guò)程的干預(yù),分析胞外Ca2+及鈣池操縱的鈣離子通道在慢性乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高及肝細(xì)胞損傷中的作用。 方法 1.細(xì)胞培養(yǎng)：人HepG2肝癌細(xì)胞株,高糖DMEM+10%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng),當(dāng)達(dá)到80-90%融合時(shí)傳代,實(shí)驗(yàn)采用第4-8代細(xì)胞。 2.實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(PBS刺激),乙醇慢性刺激組(濃度梯度分別為25mM、50mM、100mM、200mM、400mM、800mM,刺激24小時(shí))；乙醇+EGTA處理組(EGTA濃度梯度分別為0.25mM、0.5mM、1mM),乙醇+2-APB處理組(2-APB濃度梯度分別為25gM、50gM、75gM、100gM),乙醇+La3+處理組(La3+濃度梯度分別為0.1gM、1gM、10μM) 3.肝細(xì)胞[Ca2+]cyt檢測(cè)：Fluo-3/AM或Fura-2/AM標(biāo)記肝細(xì)胞Ca2+,流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均單個(gè)肝細(xì)胞[Ca2+]cyt,光譜掃描多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)總肝細(xì)胞[Ca2+]cyt。 4.細(xì)胞存活率檢測(cè)：采用臺(tái)盼藍(lán)據(jù)染和CCK-8試劑盒兩種方法觀(guān)察乙醇刺激及EGTA、2-APB、La3+干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞存活的影響。 5.肝細(xì)胞損傷檢測(cè)：收集各組肝細(xì)胞培養(yǎng)上清,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)乙醇刺激及EGTA、2-APB、La3+干預(yù)對(duì)ALT、AST漏出含量的影響。 結(jié)果 1.乙醇刺激對(duì)HepG2細(xì)胞存活率及細(xì)胞損傷影響：0-800mM乙醇(刺激24h)濃度依賴(lài)性降低HepG2細(xì)胞存活率,增高細(xì)胞培養(yǎng)基上清ALT、AST漏出量。200mM乙醇刺激時(shí)HepG2細(xì)胞存活率為65.28±7.38%(臺(tái)盼藍(lán))及67.83±4.41%(CCK8),因此選擇200mM乙醇作為下一步的刺激實(shí)驗(yàn)濃度。 2.乙醇刺激對(duì)HepG2細(xì)胞Ca2+濃度的影響：0-400mM乙醇濃度依賴(lài)性增高HepG2細(xì)胞胞漿游離Ca2+濃度,且光譜掃描多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)總肝細(xì)胞[Ca2+.]cyt水平高于流式細(xì)胞儀檢測(cè)的平均單個(gè)肝細(xì)胞[Ca2+]i水平。 3. EGTA、2-APB、La3+干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞Ca2+濃度的影響：EGTA、2-APB、La3+干預(yù)濃度依賴(lài)性降低200mM乙醇刺激HepG2細(xì)胞增高的[Ca2+]i水平,三者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4. EGTA、2-APB、La3+干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率及細(xì)胞損傷影響：與200mM乙醇刺激組相比,EGTA、2-APB、La3+干預(yù)濃度依賴(lài)性增高HepG2細(xì)胞存活率,降低細(xì)胞培養(yǎng)基上清ALT、AST漏出量,三者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論 1.體外乙醇慢性刺激濃度依賴(lài)性增高HepG2細(xì)胞Ca2+濃度并加重細(xì)胞損傷,可作為乙醇刺激肝細(xì)胞損傷的體外研究模型。 2.胞外Ca2+內(nèi)流參與乙醇慢性刺激HepG2細(xì)胞Ca2+濃度增高,由于EGTA、2-APB、La3+三者之間的干預(yù)效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,因此通過(guò)鈣池操縱的鈣離子通道的胞外Ca2+內(nèi)流可能是其中的主要成分,且鈣池操縱的鈣離子通道介導(dǎo)的胞外Ca2+內(nèi)流參與乙醇所致的肝細(xì)胞損傷。 3. EGTA、2-APB、La3+干預(yù)不能完全抑制乙醇所致的HepG2細(xì)胞Ca2+濃度增高,因此除胞外Ca2+內(nèi)流外,胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2+釋放也參與乙醇刺激所致的HepG2細(xì)胞Ca2+濃度增高及細(xì)胞損傷。 二、體內(nèi)外慢性乙醇刺激誘導(dǎo)肝細(xì)胞鈣池操縱鈣離子通道分子表達(dá)增高 目的 檢測(cè)體外慢性乙醇刺激對(duì)HepG2細(xì)胞鈣池操縱鈣離子通道蛋白主要組成分子STIM1及Orail表達(dá)的影響,檢測(cè)STIM1及Orail在慢性酒精性肝病大鼠模型肝組織中的表達(dá)、定位,分析STIM1及Orail與肝組織損傷的關(guān)系,探討SOCs參與乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞鈣超載及相關(guān)損傷的具體途徑。 方法 1.體外實(shí)驗(yàn)：人HepG2細(xì)胞株,高糖DMEM+10%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng),當(dāng)達(dá)到80-90%融合時(shí)傳代,種入6孔板,細(xì)胞貼壁后進(jìn)行刺激。細(xì)胞分為正常對(duì)照組(PBS刺激),乙醇慢性刺激24h組、48h組、72h組。 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：40只成年雄性Wistar大鼠正常飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組及ALD模型組。模型組橄欖油拌平衡飼料喂養(yǎng)大鼠的基礎(chǔ)上,大鼠給予每日兩次白酒胃內(nèi)灌注,白酒折算成酒精后其量及濃度每?jī)芍苓f增一次。正常對(duì)照組給予等量生理鹽水每日兩次灌胃。各組大鼠于16周全部處死。取肝組織標(biāo)本,通過(guò)HE染色觀(guān)察肝臟病理學(xué)改變。 3. SOCs通道蛋白分子STIM1及Orai1表達(dá)檢測(cè)：各組HepG2細(xì)胞及ALD大鼠肝組織提取總RNA及總蛋白,熒光定量-PCR和Western blot檢測(cè)STIM1及Orail基因和蛋白表達(dá),肝組織行免疫組化檢測(cè)STIM1及Orail定位改變。 結(jié)果 1.體外慢性乙醇刺激對(duì)HepG2細(xì)胞SOCs通道蛋白表達(dá)的影響：與正常對(duì)照組相比,200mM乙醇刺激明顯增加HepG2細(xì)胞STIM1及Orail的基因及蛋白表達(dá)量,且其表達(dá)增加持續(xù)至少72h。 2.慢性酒精性肝病大鼠造模情況：與對(duì)照組相比,模型組大鼠精神萎靡、體重增長(zhǎng)緩慢,肝重/體重比增加,肝組織HE染色可觀(guān)察到肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、灶狀壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 3.慢性酒精性肝病大鼠肝組織SOCs通道蛋白表達(dá)：與正常對(duì)照組相比,ALD大鼠肝組織STIM1及Orail的基因及蛋白表達(dá)量明顯增高,免疫組化顯示正常對(duì)照組見(jiàn)少量STIM1及Orail陽(yáng)性顆粒分布于中央靜脈及匯管區(qū)周?chē)?STIM1呈胞漿及胞膜表達(dá),Orail呈胞膜表達(dá),ALD模型組大鼠STIM1及Orail陽(yáng)性顆粒明顯增多,分布類(lèi)似,主要分布于酒精性肝損傷中易受損的肝腺泡三區(qū),STIM1呈胞膜聚集趨勢(shì)。 結(jié)論 體內(nèi)外研究均顯示慢性乙醇刺激可增加肝細(xì)胞SOCs通道蛋白STIM1與Orail的表達(dá),且兩者呈平行性增加,提示乙醇可能通過(guò)增高SOCs通道蛋白分子表達(dá),增加胞外鈣離子內(nèi)流而加重肝細(xì)胞損傷。 三、鈣池操縱鈣離子通道蛋白R(shí)NA干擾對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高及肝細(xì)胞損傷的影響 目的 觀(guān)察針對(duì)SOCs通道蛋白分子STIM1及Orail的RNA干擾對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高及肝細(xì)胞損傷的影響,進(jìn)一步明確STIM1及Orail在SOCs參與乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞鈣超載及相關(guān)損傷中各自的作用。 方法 1.小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)設(shè)計(jì)合成篩選：根據(jù)在Genebank中檢索的人STIM1、Orail基因序列,利用Sofld軟件設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)人STIM1、Orail基因的siRNA序列。應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,Western Blot驗(yàn)證其對(duì)STIM1、Orail表達(dá)抑制的有效性,挑選抑制效應(yīng)最強(qiáng)的siRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 2. STIM1及Orail的RNA干擾對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高及肝細(xì)胞損傷的影響：HepG2細(xì)胞,分別設(shè)立乙醇誘導(dǎo)組、干擾對(duì)照組、STIM1干擾組、Orail干擾組及STIM1/Orail共同干擾組,按照第一部分的方法進(jìn)行肝細(xì)胞[Ca2+]cyt檢測(cè)、細(xì)胞存活率檢測(cè)及肝細(xì)胞損傷檢測(cè)。 結(jié)果 1.STIM1、Orail SiRNA篩選：篩選出針對(duì)人STIM1、Orail的siRNA序列各一條,Western Blot驗(yàn)證可有效抑制STIM1、Orail蛋白表達(dá),抑制效率在60-70%。 2. STIM1及Orail的RNA干擾對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞Ca2+濃度增高的影響：針對(duì)STIM1及STIM1/Orail的RNA干擾可有效降低乙醇引起的HepG2細(xì)胞Ca2+濃度增高,且Si-STIM1/Orail組略低于Si-STIM1組,但單獨(dú)針對(duì)Orail的RNA干擾不能有效降低乙醇引起的HepG2細(xì)胞Ca2+濃度增高。 3. STIM1及Orail的RNA干擾對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的影響：針對(duì)STIM1及STIM1/Orail的RNA干擾可有效增高200mM乙醇刺激后HepG2的細(xì)胞存活率,降低200mM乙醇刺激后HepG2培養(yǎng)上清中ALT、AST的含量,但單獨(dú)針對(duì)Orail的RNA干擾無(wú)顯著作用。 結(jié)論 慢性乙醇刺激可能主要通過(guò)增高STIM1表達(dá),增加SOCs通道開(kāi)放的頻率,使胞外鈣離子內(nèi)流增多,從而加重肝細(xì)胞損傷,同時(shí)乙醇刺激肝細(xì)胞Orail表達(dá)增多,使SOCs孔通道增多,以輔助STI1作用。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R749.6

【參考文獻(xiàn)】

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1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組;;酒精性肝病診療指南[J];中國(guó)肝臟病雜志(電子版);2010年04期

2 朱萍;閻明;張莉;王旭平;商楠;劉慧敏;張海濤;;乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞線(xiàn)粒體質(zhì)量和跨膜電位變化的研究[J];中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展;2007年02期

3 王曉英;閻明;;肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)及乙醛對(duì)肝細(xì)胞的形態(tài)影響[J];中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥;2008年04期

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本文編號(hào)：2121957