本文選題：GPR39 + HT-22細胞　； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景G蛋白偶聯(lián)受體39(G protein-coupled receptor39,GPR39)是一種視紫紅質樣G蛋白偶聯(lián)受體,根據(jù)其氨基酸序列也被歸為胃饑餓素(Ghrelin)受體家族的一員,由462個氨基酸殘基構成,具有7個跨膜結構域,表達于所有的脊椎動物中。1997年Mc Kee教授等第一次從人類胎兒大腦c DNA中克隆出GPR39和GPR38。最初的報告顯示這些新型的G蛋白偶聯(lián)受體與饑餓素和神經降壓素(Neurotensin)受體有關。GPR39主要表達于胃腸道、肝、脂肪組織和胰腺,此外在中樞神經系統(tǒng)也有廣泛表達,如杏仁核、海馬等,這些部位同時也是鋅富集的區(qū)域,提示鋅在中樞的神經遞質作用可能和GPR39有關。相關研究也顯示海馬CA3區(qū)谷氨酸能終端釋放的鋅可激活突觸后膜的GPR39受體,并調節(jié)情緒和認知。近來研究進一步證實缺鋅可以導致GPR39表達下降,前額皮質GPR39減少與強迫游泳不動時間增加相關。研究發(fā)現(xiàn),選擇性抗抑郁藥物,如依他普侖、瑞波西汀、安非他酮等可以增加GPR39的表達。越來越多的證據(jù)提示GPR39可能具有抗抑郁作用,但其具體的機制仍未完全闡明。抑郁癥是多因素引起的精神障礙性疾病,患者主要表現(xiàn)為自尊感低、免疫系統(tǒng)功能紊亂、食欲減退、并伴隨著社交障礙、工作效率下降、社會心理脆弱和生活質量和幸福感下降。抑郁癥的特點是改變人的情緒和認知功能甚至使患者反復產生死亡或自殺的想法。中國每年有20萬人因抑郁癥自殺,不僅給患者自己而且給家人都帶來了巨大的身心折磨。然而至今抑郁癥病因和發(fā)病機制都未完全闡明。但可以肯定,生物、心理以及環(huán)境等多因素參與了抑郁癥的發(fā)病過程。實驗研究發(fā)現(xiàn),慢性應激誘導抑郁發(fā)生與大腦神經元和神經膠質細胞萎縮和凋亡有關,應激大鼠海馬萎縮、神經元形態(tài)改變并大量缺失、神經生長因子表達減少、記憶與認知功能下降。機體應激時,下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)被激活并分泌大量糖皮質激素(Glucocorticoids,GC)結合靶器官上的糖皮質激素受體發(fā)揮作用。而海馬富含糖皮質激素受體,因此是應激時最容易受損的腦區(qū)。鼠類糖皮質激素主要是皮質酮。課題組既往實驗運用皮質酮干預海馬神經細胞后發(fā)現(xiàn),細胞數(shù)量減少、細胞腫脹、排列紊亂、間隙增大、尼氏質減少;而對照組細胞排列整齊、密集、胞漿中清晰可見尼氏質。實驗研究表明,應激導致神經元損傷,抑制神經元再生;從而導致神經元萎縮、減少、海馬結構和功能受損等與抑郁的發(fā)生密切相關。海馬是中樞神經系統(tǒng)中鋅含量最為豐富的區(qū)域,而海馬與學習、記憶以及行為和情緒密切相關。我們既往研究顯示,應激可誘導海馬鋅穩(wěn)態(tài)的紊亂,并且可以導致動物行為學發(fā)生抑郁樣的變化,并發(fā)現(xiàn)有抑郁樣行為改變的小鼠海馬GPR39 m RNA表達明顯減少。實驗研究發(fā)現(xiàn)GPR39基因敲除小鼠模型呈現(xiàn)出抑郁樣行為改變,海馬環(huán)磷腺苷反應元件結合蛋白(c AMP response element binding protein,CREB)、腦源性神經營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)水平降低,給予抗抑郁藥治療后BDNF蛋白水平上調,這可能與GPR39表達上調有關。CREB是一種核內蛋白,在體內主要調節(jié)基因的轉錄,因此也稱為調節(jié)轉錄核因子。研究表明,CREB可以調控海馬內基因轉錄,有利于海馬長時程記憶的形成。此外,CREB是誘導BDNF產生的轉錄因子,CREB-BDNF這一通路對神經生長發(fā)育具有重要作用,并與神經和情緒障礙疾病如焦慮和抑郁等密切相關。BDNF在神經系統(tǒng)內廣泛分布,在維持神經元存活和促進突觸生長的過程中具有重要作用。因此,我們推測GPR39調控的CREB-BDNF信號通路可能是其神經保護作用途徑之一。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)慢性應激引起鋅穩(wěn)態(tài)紊亂誘導海馬神經元凋亡增加,在抑郁的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用,且抑郁樣行為改變的小鼠海馬GPR39m RNA表達降低,近來研究進一步發(fā)現(xiàn)缺鋅可以導致GPR39表達下降。因此應激致海馬鋅穩(wěn)態(tài)紊亂可能是應激致抑郁樣行為變化的物質基礎,而應激致腦區(qū)海馬神經細胞損傷可能是抑郁障礙的病理學基礎,我們推測鋅可能通過激活GPR39受體,進而調節(jié)與神經生長發(fā)育密切相關的CREB-BDNF信號通路和細胞凋亡信號通路發(fā)揮作用。實驗目的通過觀察HT-22細胞中GPR39的表達與鋅離子之間的關系,并應用皮質酮處理HT-22細胞,檢測皮質酮對小鼠海馬神經細胞活性、線粒體膜電位和細胞凋亡的影響;培養(yǎng)體系內加入GPR39激動劑或轉染GPR39 Si RNA,觀察其在皮質酮致神經元損傷中的作用,并進一步對CREB-BDNF和凋亡信號通路進行分析。從而闡明鋅受體GPR39神經保護作用及機制,為抑郁癥的的防治提供新的實驗基礎和理論依據(jù)。實驗方法1、細胞培養(yǎng)小鼠海馬HT-22細胞,由David Schubert教授(加拿大,沙克研究所)饋贈。37℃、5%CO2的條件下,用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HT-22細胞。2、細胞干預(1)采用濃度梯度的硫酸鋅(0μΜ、25μΜ、50μΜ、100μΜ、200μΜ)處理細胞6h和50μΜ硫酸鋅按時間曲線(0 h、3h、6h、12h、18h、24h)處理HT-22細胞;硫酸鋅干預HT-22細胞30min后,10μΜTPEN和DTPA干預HT-22細胞6h。(2)10μΜ濃度CORT按時間曲線(0h、3h、6h、12h、24h)和濃度梯度CORT(0n M、500n M、1μΜ、10μΜ、50μΜ)處理HT-22細胞6h。(3)采用0.5μΜ濃度GPR39激動劑(TCG-1008)按時間曲線(0h、3h、6h、12h、24h)和濃度梯度TCG-1008(0μΜ、0.1μΜ、0.25μΜ、0.5μΜ、1μΜ)處理HT-22細胞24h。3、細胞轉染HT-22細胞接種培養(yǎng)板,當融合度為80%時,按說明書進行轉染,將GPR39干擾小RNA以及轉染試劑lipofctamine2000分別用DMEM稀釋后混勻,37℃、5%CO2的條件下靜置20min。每孔預先加入配制好的培養(yǎng)基(不含抗生素),再加入上述混合液。一般6h換液,繼續(xù)培養(yǎng)至24h,進行后續(xù)實驗。4、HT-22細胞活性的測定采用CCK-8試劑盒檢測HT-22細胞活性。5、線粒體膜電位的測定采用JC-1試劑盒檢測HT-22細胞線粒體膜電位。6、細胞凋亡的測定采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測HT-22細胞凋亡情況。用RIPA裂解液提取HT-22細胞的總蛋白,熱變性10min。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳2h,轉膜1.5h,5%牛奶封閉2h,孵育一抗過夜,漂洗8-10min×3次,二抗孵育2h,漂洗后顯影。8、實時定量熒光PCRTrizol提取HT-22細胞總RNA并定量,用反轉錄試劑盒將提取好的RNA反轉錄成c DNA。以c DNA為模板,與水、SYBRgreen以及引物混勻后,擴增。9、統(tǒng)計方法SPSS16.0進行數(shù)據(jù)分析,采用單因素方差分析(one-way ANVOA)和兩獨立樣本t檢驗進行每組之間的比較,多組間兩兩比較采用SNK-q、Dunnett’s檢驗。設置顯著性水平為P0.05,P0.01為非常顯著性水平。實驗結果1、鋅對HT-22細胞GPR39表達的影響50μΜ硫酸鋅分別干預HT-22細胞不同時間,結果發(fā)現(xiàn)3h組和6h組GPR39表達顯著升高(P0.05);用25μM、50μM、100μM和200μM硫酸鋅分別干預HT-22細胞6h發(fā)現(xiàn),50μM硫酸鋅干預后GPR39表達顯著增加(P0.05);給予10μM TPEN和DTPA干預HT-22細胞,與對照組相比,單獨給予鋅離子螯合劑TPEN組和DTPA組GPR39蛋白表達顯著降低(P0.01);而與TPEN組和DTPA組相比,Zn2++TPEN和Zn2++DTPA組GPR39表達顯著增加(P0.05)。2、CORT對HT-22細胞活性的影響結果顯示,與對照組相比,1μΜ、10μΜ和50μΜ組細胞活性顯著減弱(P0.05);使用500nΜCORT干預HT-22細胞不同時間,與對照組相比,12h、24h組細胞活性顯著減弱(P0.01)。3、干擾和激活GPR39對皮質酮處理HT-22細胞活性的影響實驗結果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,500n M CORT干預對細胞活性沒有影響(P0.05),而干擾GPR39表達后,與500n M CORT組相比,Si RNA+500n M CORT組細胞活性明顯降低(P0.05)。與空白對照組相比,Si組與1μΜCORT組細胞活性顯著降低(P0.01);而給予0.5μΜGPR39激動劑(TCG-1008)后,7、Western-blot與Si組相比Si RNA+TCG-1008組細胞活性水平升高(P0.05);與1μΜCORT組相比,1μΜCORT+TCG-1008組細胞活性水平升高(P0.01)。4、干擾和激活GPR39對皮質酮處理HT-22細胞凋亡的影響實驗結果表明,與對照組相比,500n M CORT組無明顯變化,與500n M CORT組相比,Si RNA+500n M CORT組細胞凋亡明顯增加(P0.001)。與對照組相比,1μΜCORT組細胞凋亡顯著增加(P0.001);而與1μΜCORT組相比,給予GPR9激動劑TCG-1008后,1μΜCORT+TCG-1008組凋亡顯著下降(P0.001)并恢復至對照水平。5、干擾和激活GPR39對皮質酮干預HT-22細胞線粒體膜電位的影響與對照組相比,500n M CORT組線粒體膜電位無明顯變化,與500n M CORT組相比,Si RNA+500n M CORT組線粒體膜電位明顯下降(P0.001)。與對照組相比,1μΜCORT組線粒體膜電位顯著下降(P0.001);而與1μΜCORT組相比,給予GPR9激動劑TCG-1008后,1μΜCORT+TCG-1008組線粒體膜電位顯著升高(P0.001)并恢復至對照水平。6、硫酸鋅對HT-22細胞CREB和BDNF表達的影響與對照相比,50μM硫酸鋅可以促進CREB和BDNF m RNA和蛋白表達增加(P0.05)而200μM硫酸鋅組CREB和BDNF m RNA和蛋白表達明顯減少(P0.05)。7、皮質酮對HT-22細胞GPR39及CREB-BDNF信號通路的影響不同濃度CORT處理HT-22細胞,結果顯示,與對照相比,500n M CORT組GPR39表達顯著增加(P0.05),1μM、25μM和50μM CORT組GPR39表達顯著下降(P0.05);CREB和BDNF表達變化與GPR39一致。8、干擾和激活GPR39對CREB-BDNF信號通路的影響實驗結果顯示,干擾組CREB和BDNF表達均顯著降低(P0.01),而0.5μM TCG-1008干預HT-22細胞24h,發(fā)現(xiàn)CREB、BDNF m RNA和蛋白水平都有顯著增加(P0.05)。9、干擾和激活GPR39對細胞凋亡信號通路的影響結果顯示,與對照組相比,500n M CORT組Caspase3、Caspase9、AIF以及BAX m RNA表達無明顯變化,而Bcl-2 m RNA表達顯著增加(P0.01);而與500n M CORT組相比,Si+500n M CORT組Caspase3、Caspase9、AIF以及BAX m RNA表達顯著增加(P0.01),Bcl-2 m RNA表達明顯降低(P0.01)。與1μM CORT組相比,1μM CORT+TCG-1008組Caspase3、Caspase9、AIF以及BAX m RNA表達顯著降低(P0.01),Bcl-2 m RNA表達顯著增加(P0.01)。結論本研究首次對鋅受體GPR39在小鼠海馬HT-22細胞中的神經保護作用及其可能機制進行系統(tǒng)的研究,通過CORT處理HT-22細胞,觀察應激對細胞活性、線粒體功能以及細胞凋亡等方面的影響;通過干擾和激活GPR39,觀察其在細胞應激時的作用,并進一步對其作用機制進行探討。主要結論如下:1、鋅作為GPR39的配體,能夠激活GPR39并促進其表達增加。2、GPR39對皮質酮所致的HT-22細胞損傷具有保護作用。3、GPR39可能通過促進CREB-BDNF表達和抑制促凋亡蛋白BAX、Caspase3、Caspase9以及AIF表達,上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達發(fā)揮神經保護作用。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R749.4

【參考文獻】

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1 余匯;陳佳佳;曾冰清;鐘秋萍;徐江平;劉永剛;;cAMP/CREB/BDNF信號通路在沃替西汀抗小鼠抑郁樣行為中的作用[J];南方醫(yī)科大學學報;2017年01期

2 張征;鄒大進;陳月;王淼;吳捷;郭志福;;Obestatin抑制3T3-L1前脂肪細胞的增殖與分化[J];第二軍醫(yī)大學學報;2007年09期

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本文編號：1940444