本文選題：GPR39 + HT-22細(xì)胞　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景G蛋白偶聯(lián)受體39(G protein-coupled receptor39,GPR39)是一種視紫紅質(zhì)樣G蛋白偶聯(lián)受體,根據(jù)其氨基酸序列也被歸為胃饑餓素(Ghrelin)受體家族的一員,由462個氨基酸殘基構(gòu)成,具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域,表達(dá)于所有的脊椎動物中。1997年Mc Kee教授等第一次從人類胎兒大腦c DNA中克隆出GPR39和GPR38。最初的報(bào)告顯示這些新型的G蛋白偶聯(lián)受體與饑餓素和神經(jīng)降壓素(Neurotensin)受體有關(guān)。GPR39主要表達(dá)于胃腸道、肝、脂肪組織和胰腺,此外在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有廣泛表達(dá),如杏仁核、海馬等,這些部位同時也是鋅富集的區(qū)域,提示鋅在中樞的神經(jīng)遞質(zhì)作用可能和GPR39有關(guān)。相關(guān)研究也顯示海馬CA3區(qū)谷氨酸能終端釋放的鋅可激活突觸后膜的GPR39受體,并調(diào)節(jié)情緒和認(rèn)知。近來研究進(jìn)一步證實(shí)缺鋅可以導(dǎo)致GPR39表達(dá)下降,前額皮質(zhì)GPR39減少與強(qiáng)迫游泳不動時間增加相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),選擇性抗抑郁藥物,如依他普侖、瑞波西汀、安非他酮等可以增加GPR39的表達(dá)。越來越多的證據(jù)提示GPR39可能具有抗抑郁作用,但其具體的機(jī)制仍未完全闡明。抑郁癥是多因素引起的精神障礙性疾病,患者主要表現(xiàn)為自尊感低、免疫系統(tǒng)功能紊亂、食欲減退、并伴隨著社交障礙、工作效率下降、社會心理脆弱和生活質(zhì)量和幸福感下降。抑郁癥的特點(diǎn)是改變?nèi)说那榫w和認(rèn)知功能甚至使患者反復(fù)產(chǎn)生死亡或自殺的想法。中國每年有20萬人因抑郁癥自殺,不僅給患者自己而且給家人都帶來了巨大的身心折磨。然而至今抑郁癥病因和發(fā)病機(jī)制都未完全闡明。但可以肯定,生物、心理以及環(huán)境等多因素參與了抑郁癥的發(fā)病過程。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),慢性應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁發(fā)生與大腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞萎縮和凋亡有關(guān),應(yīng)激大鼠海馬萎縮、神經(jīng)元形態(tài)改變并大量缺失、神經(jīng)生長因子表達(dá)減少、記憶與認(rèn)知功能下降。機(jī)體應(yīng)激時,下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)被激活并分泌大量糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids,GC)結(jié)合靶器官上的糖皮質(zhì)激素受體發(fā)揮作用。而海馬富含糖皮質(zhì)激素受體,因此是應(yīng)激時最容易受損的腦區(qū)。鼠類糖皮質(zhì)激素主要是皮質(zhì)酮。課題組既往實(shí)驗(yàn)運(yùn)用皮質(zhì)酮干預(yù)海馬神經(jīng)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞腫脹、排列紊亂、間隙增大、尼氏質(zhì)減少;而對照組細(xì)胞排列整齊、密集、胞漿中清晰可見尼氏質(zhì)。實(shí)驗(yàn)研究表明,應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,抑制神經(jīng)元再生;從而導(dǎo)致神經(jīng)元萎縮、減少、海馬結(jié)構(gòu)和功能受損等與抑郁的發(fā)生密切相關(guān)。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中鋅含量最為豐富的區(qū)域,而海馬與學(xué)習(xí)、記憶以及行為和情緒密切相關(guān)。我們既往研究顯示,應(yīng)激可誘導(dǎo)海馬鋅穩(wěn)態(tài)的紊亂,并且可以導(dǎo)致動物行為學(xué)發(fā)生抑郁樣的變化,并發(fā)現(xiàn)有抑郁樣行為改變的小鼠海馬GPR39 m RNA表達(dá)明顯減少。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)GPR39基因敲除小鼠模型呈現(xiàn)出抑郁樣行為改變,海馬環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(c AMP response element binding protein,CREB)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)水平降低,給予抗抑郁藥治療后BDNF蛋白水平上調(diào),這可能與GPR39表達(dá)上調(diào)有關(guān)。CREB是一種核內(nèi)蛋白,在體內(nèi)主要調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄,因此也稱為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄核因子。研究表明,CREB可以調(diào)控海馬內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄,有利于海馬長時程記憶的形成。此外,CREB是誘導(dǎo)BDNF產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子,CREB-BDNF這一通路對神經(jīng)生長發(fā)育具有重要作用,并與神經(jīng)和情緒障礙疾病如焦慮和抑郁等密切相關(guān)。BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布,在維持神經(jīng)元存活和促進(jìn)突觸生長的過程中具有重要作用。因此,我們推測GPR39調(diào)控的CREB-BDNF信號通路可能是其神經(jīng)保護(hù)作用途徑之一。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激引起鋅穩(wěn)態(tài)紊亂誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡增加,在抑郁的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用,且抑郁樣行為改變的小鼠海馬GPR39m RNA表達(dá)降低,近來研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)缺鋅可以導(dǎo)致GPR39表達(dá)下降。因此應(yīng)激致海馬鋅穩(wěn)態(tài)紊亂可能是應(yīng)激致抑郁樣行為變化的物質(zhì)基礎(chǔ),而應(yīng)激致腦區(qū)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷可能是抑郁障礙的病理學(xué)基礎(chǔ),我們推測鋅可能通過激活GPR39受體,進(jìn)而調(diào)節(jié)與神經(jīng)生長發(fā)育密切相關(guān)的CREB-BDNF信號通路和細(xì)胞凋亡信號通路發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^觀察HT-22細(xì)胞中GPR39的表達(dá)與鋅離子之間的關(guān)系,并應(yīng)用皮質(zhì)酮處理HT-22細(xì)胞,檢測皮質(zhì)酮對小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞活性、線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡的影響;培養(yǎng)體系內(nèi)加入GPR39激動劑或轉(zhuǎn)染GPR39 Si RNA,觀察其在皮質(zhì)酮致神經(jīng)元損傷中的作用,并進(jìn)一步對CREB-BDNF和凋亡信號通路進(jìn)行分析。從而闡明鋅受體GPR39神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制,為抑郁癥的的防治提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法1、細(xì)胞培養(yǎng)小鼠海馬HT-22細(xì)胞,由David Schubert教授(加拿大,沙克研究所)饋贈。37℃、5%CO2的條件下,用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HT-22細(xì)胞。2、細(xì)胞干預(yù)(1)采用濃度梯度的硫酸鋅(0μΜ、25μΜ、50μΜ、100μΜ、200μΜ)處理細(xì)胞6h和50μΜ硫酸鋅按時間曲線(0 h、3h、6h、12h、18h、24h)處理HT-22細(xì)胞;硫酸鋅干預(yù)HT-22細(xì)胞30min后,10μΜTPEN和DTPA干預(yù)HT-22細(xì)胞6h。(2)10μΜ濃度CORT按時間曲線(0h、3h、6h、12h、24h)和濃度梯度CORT(0n M、500n M、1μΜ、10μΜ、50μΜ)處理HT-22細(xì)胞6h。(3)采用0.5μΜ濃度GPR39激動劑(TCG-1008)按時間曲線(0h、3h、6h、12h、24h)和濃度梯度TCG-1008(0μΜ、0.1μΜ、0.25μΜ、0.5μΜ、1μΜ)處理HT-22細(xì)胞24h。3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染HT-22細(xì)胞接種培養(yǎng)板,當(dāng)融合度為80%時,按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將GPR39干擾小RNA以及轉(zhuǎn)染試劑lipofctamine2000分別用DMEM稀釋后混勻,37℃、5%CO2的條件下靜置20min。每孔預(yù)先加入配制好的培養(yǎng)基(不含抗生素),再加入上述混合液。一般6h換液,繼續(xù)培養(yǎng)至24h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4、HT-22細(xì)胞活性的測定采用CCK-8試劑盒檢測HT-22細(xì)胞活性。5、線粒體膜電位的測定采用JC-1試劑盒檢測HT-22細(xì)胞線粒體膜電位。6、細(xì)胞凋亡的測定采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測HT-22細(xì)胞凋亡情況。用RIPA裂解液提取HT-22細(xì)胞的總蛋白,熱變性10min。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳2h,轉(zhuǎn)膜1.5h,5%牛奶封閉2h,孵育一抗過夜,漂洗8-10min×3次,二抗孵育2h,漂洗后顯影。8、實(shí)時定量熒光PCRTrizol提取HT-22細(xì)胞總RNA并定量,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA。以c DNA為模板,與水、SYBRgreen以及引物混勻后,擴(kuò)增。9、統(tǒng)計(jì)方法SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用單因素方差分析(one-way ANVOA)和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行每組之間的比較,多組間兩兩比較采用SNK-q、Dunnett’s檢驗(yàn)。設(shè)置顯著性水平為P0.05,P0.01為非常顯著性水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、鋅對HT-22細(xì)胞GPR39表達(dá)的影響50μΜ硫酸鋅分別干預(yù)HT-22細(xì)胞不同時間,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3h組和6h組GPR39表達(dá)顯著升高(P0.05);用25μM、50μM、100μM和200μM硫酸鋅分別干預(yù)HT-22細(xì)胞6h發(fā)現(xiàn),50μM硫酸鋅干預(yù)后GPR39表達(dá)顯著增加(P0.05);給予10μM TPEN和DTPA干預(yù)HT-22細(xì)胞,與對照組相比,單獨(dú)給予鋅離子螯合劑TPEN組和DTPA組GPR39蛋白表達(dá)顯著降低(P0.01);而與TPEN組和DTPA組相比,Zn2++TPEN和Zn2++DTPA組GPR39表達(dá)顯著增加(P0.05)。2、CORT對HT-22細(xì)胞活性的影響結(jié)果顯示,與對照組相比,1μΜ、10μΜ和50μΜ組細(xì)胞活性顯著減弱(P0.05);使用500nΜCORT干預(yù)HT-22細(xì)胞不同時間,與對照組相比,12h、24h組細(xì)胞活性顯著減弱(P0.01)。3、干擾和激活GPR39對皮質(zhì)酮處理HT-22細(xì)胞活性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,500n M CORT干預(yù)對細(xì)胞活性沒有影響(P0.05),而干擾GPR39表達(dá)后,與500n M CORT組相比,Si RNA+500n M CORT組細(xì)胞活性明顯降低(P0.05)。與空白對照組相比,Si組與1μΜCORT組細(xì)胞活性顯著降低(P0.01);而給予0.5μΜGPR39激動劑(TCG-1008)后,7、Western-blot與Si組相比Si RNA+TCG-1008組細(xì)胞活性水平升高(P0.05);與1μΜCORT組相比,1μΜCORT+TCG-1008組細(xì)胞活性水平升高(P0.01)。4、干擾和激活GPR39對皮質(zhì)酮處理HT-22細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對照組相比,500n M CORT組無明顯變化,與500n M CORT組相比,Si RNA+500n M CORT組細(xì)胞凋亡明顯增加(P0.001)。與對照組相比,1μΜCORT組細(xì)胞凋亡顯著增加(P0.001);而與1μΜCORT組相比,給予GPR9激動劑TCG-1008后,1μΜCORT+TCG-1008組凋亡顯著下降(P0.001)并恢復(fù)至對照水平。5、干擾和激活GPR39對皮質(zhì)酮干預(yù)HT-22細(xì)胞線粒體膜電位的影響與對照組相比,500n M CORT組線粒體膜電位無明顯變化,與500n M CORT組相比,Si RNA+500n M CORT組線粒體膜電位明顯下降(P0.001)。與對照組相比,1μΜCORT組線粒體膜電位顯著下降(P0.001);而與1μΜCORT組相比,給予GPR9激動劑TCG-1008后,1μΜCORT+TCG-1008組線粒體膜電位顯著升高(P0.001)并恢復(fù)至對照水平。6、硫酸鋅對HT-22細(xì)胞CREB和BDNF表達(dá)的影響與對照相比,50μM硫酸鋅可以促進(jìn)CREB和BDNF m RNA和蛋白表達(dá)增加(P0.05)而200μM硫酸鋅組CREB和BDNF m RNA和蛋白表達(dá)明顯減少(P0.05)。7、皮質(zhì)酮對HT-22細(xì)胞GPR39及CREB-BDNF信號通路的影響不同濃度CORT處理HT-22細(xì)胞,結(jié)果顯示,與對照相比,500n M CORT組GPR39表達(dá)顯著增加(P0.05),1μM、25μM和50μM CORT組GPR39表達(dá)顯著下降(P0.05);CREB和BDNF表達(dá)變化與GPR39一致。8、干擾和激活GPR39對CREB-BDNF信號通路的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾組CREB和BDNF表達(dá)均顯著降低(P0.01),而0.5μM TCG-1008干預(yù)HT-22細(xì)胞24h,發(fā)現(xiàn)CREB、BDNF m RNA和蛋白水平都有顯著增加(P0.05)。9、干擾和激活GPR39對細(xì)胞凋亡信號通路的影響結(jié)果顯示,與對照組相比,500n M CORT組Caspase3、Caspase9、AIF以及BAX m RNA表達(dá)無明顯變化,而Bcl-2 m RNA表達(dá)顯著增加(P0.01);而與500n M CORT組相比,Si+500n M CORT組Caspase3、Caspase9、AIF以及BAX m RNA表達(dá)顯著增加(P0.01),Bcl-2 m RNA表達(dá)明顯降低(P0.01)。與1μM CORT組相比,1μM CORT+TCG-1008組Caspase3、Caspase9、AIF以及BAX m RNA表達(dá)顯著降低(P0.01),Bcl-2 m RNA表達(dá)顯著增加(P0.01)。結(jié)論本研究首次對鋅受體GPR39在小鼠海馬HT-22細(xì)胞中的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究,通過CORT處理HT-22細(xì)胞,觀察應(yīng)激對細(xì)胞活性、線粒體功能以及細(xì)胞凋亡等方面的影響;通過干擾和激活GPR39,觀察其在細(xì)胞應(yīng)激時的作用,并進(jìn)一步對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。主要結(jié)論如下:1、鋅作為GPR39的配體,能夠激活GPR39并促進(jìn)其表達(dá)增加。2、GPR39對皮質(zhì)酮所致的HT-22細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。3、GPR39可能通過促進(jìn)CREB-BDNF表達(dá)和抑制促凋亡蛋白BAX、Caspase3、Caspase9以及AIF表達(dá),上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R749.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 余匯;陳佳佳;曾冰清;鐘秋萍;徐江平;劉永剛;;cAMP/CREB/BDNF信號通路在沃替西汀抗小鼠抑郁樣行為中的作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2017年01期

2 張征;鄒大進(jìn);陳月;王淼;吳捷;郭志福;;Obestatin抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖與分化[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年09期

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本文編號：1940444