本文選題：依維莫司　切入點(diǎn)：血管性癡呆　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：背景及目的:血管性癡呆(Vascular dementia,Va D)是一種發(fā)病率高且危害嚴(yán)重的疾病,是一種因出血性或缺血性腦損傷導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙的臨床綜合征。在未來(lái)的幾十年里,Va D可能會(huì)影響越來(lái)越多的患者。因血管性癡呆復(fù)雜的病理生理變化,使得對(duì)其認(rèn)識(shí)非常的有限。小膠質(zhì)細(xì)胞功能紊亂,部分歸因于免疫微環(huán)境的紊亂,最終導(dǎo)致了認(rèn)知功能的損害�？紤]到雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mammalian target of rapamycin complex1,m TORC1)在膠質(zhì)細(xì)胞功能中的關(guān)鍵作用,我們的工作重點(diǎn)是討論是否雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)抑制劑依維莫司(Everolimus,RAD001)能夠抑制有害的小膠質(zhì)細(xì)胞功能,從而改變其表現(xiàn)型和改善因慢性腦灌注不足引起的認(rèn)知障礙。通過(guò)利用彈簧圈套扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成狹窄建立小鼠因血管因素造成的認(rèn)知障礙模型,利用水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris water maze,MWM)對(duì)小鼠進(jìn)行認(rèn)知功能的檢測(cè),以評(píng)估各組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。采取組織學(xué)觀察評(píng)估小鼠海馬區(qū)的變化,評(píng)估RAD001對(duì)認(rèn)知障礙小鼠的改善作用。另通過(guò)測(cè)定海馬區(qū)M1標(biāo)記物CD16/32、M2標(biāo)記物CD206、M1型相關(guān)炎癥因子(CD16,i NOS,TNF-α)、M2型相關(guān)炎癥因子(IL-10,TGF-β,Arg1)以及CA1區(qū)VACh T,Ch AT和ACh E的變化,探索RAD001的腦保護(hù)作用,為改善認(rèn)知障礙提供新的治療策略。方法:我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為雄性成年C57BL/6J小鼠,它們被隨機(jī)分為雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄(BCAS)組、RAD001+BCAS組、假手術(shù)組。應(yīng)用雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄法制備小鼠血管性癡呆模型。我們給雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄的小鼠0.5mg/kg劑量的依維莫司,假手術(shù)組的小鼠僅予磷酸鹽緩沖溶液(PBS),作為對(duì)照。各組取材前分別進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn);取材后,通過(guò)HE染色對(duì)海馬區(qū)的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步評(píng)價(jià);通過(guò)免疫熒光染色法去評(píng)價(jià)小鼠的膽堿能活性和lba-1(小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白),CD16/32,CD206的表達(dá)情況;通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡分析進(jìn)一步檢測(cè)M1/M2平衡的機(jī)制;通過(guò)q RT-PCR檢測(cè)M1/M2相關(guān)炎癥因子m RNA在海馬的表達(dá)情況。結(jié)果:1、水迷宮實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果。在逃避潛伏期的實(shí)驗(yàn)中,假手術(shù)組和BCAS組分別為:第1天45.1±12s,49.2±12s,P0.05;第2天40.2±8s,58.1±11s,P0.05;第3天29.2±8s,57.2±7s,P0.05;第4天25.1±7s,47.2±6s,P0.05;第5天20.1±6s,48.3±5s,P0.01。在目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比的實(shí)驗(yàn)中,假手術(shù)組和BCAS組分別為:43.52±6.17%,19.85±3.21%,P0.01。水迷宮檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄造成了小鼠認(rèn)知功能障礙。RAD001治療組與BCAS模型組相比,治療組逃避潛伏期時(shí)間:第3天35.2±5s,第4天26.3±8s,P0.05;第5天22.2±8s,P0.01。RAD001治療組目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比43.59±5.12%,P0.01。這些結(jié)果充分的證明RAD001治療能夠明顯改善因慢性腦灌注不足引起的空間障礙。2、HE染色觀察到結(jié)果:通過(guò)HE染色法能夠?qū)ι窠?jīng)元的缺失進(jìn)行評(píng)估,顯示在對(duì)小鼠進(jìn)行雙側(cè)頸動(dòng)脈狹窄處理的最初五周,小鼠海馬的CA1區(qū)的神經(jīng)元廣泛改變,顯微鏡下能夠清楚地看到神經(jīng)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞核收縮,染色變深(圖.2)。而RAD001能明顯減輕這些因長(zhǎng)期腦灌注不足導(dǎo)致的在小鼠海馬區(qū)出現(xiàn)的病理改變和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。3、通過(guò)免疫熒光法觀察到結(jié)果:在假手術(shù)組中可見(jiàn)海馬區(qū)中存在大量的Ch AT、VACh T、ACh E和少量的CD16/32、Iba-1的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),而在BCAS模型組中VACh T、Ch AT的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則顯著的減少,CD16/32和Iba-1的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則增加顯著,同時(shí)可以看到ACHE的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),但細(xì)胞的數(shù)目則減少。RAD001治療組與BCAS模型組相比,RAD001治療組的CD16/32和Iba-1的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少顯著,而VACh T、Ch AT的表達(dá)增加明顯,兩組相比P0.05。另一方面,ACh E的變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異(圖.4)。4、q RT-PCR結(jié)果顯示:氧糖剝奪(OGD)后2小時(shí)、4小時(shí)M1表型(CD16,i NOS,TNF-α)基因及M2表型(IL-10,TGF-β,Arg1)基因的表達(dá)達(dá)到頂峰(P0.01),而RAD001治療后,M1表型(CD16,i NOS,TNF-α)基因的相對(duì)表達(dá)量下降,M2表型(IL-10,TGF-β,Arg1)基因的相對(duì)表達(dá)量上升。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,圖.5)。5、蛋白電泳的結(jié)果顯示:三組中T-Akt無(wú)明顯差異,RAD001治療組與模型組比較,P-Akt蛋白量明顯增多,三組中T-p70S6k無(wú)明顯差異,模型組P-p70S6k蛋白量明顯增多,而治療組P-p70S6k的蛋白量顯著減少。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,圖6)。結(jié)論:RAD001能夠通過(guò)有效抑制m TORC1途徑而減輕因慢性腦灌注不足引起的認(rèn)知障礙。這些影響源于調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1表型向M2表型的轉(zhuǎn)化。我們的發(fā)現(xiàn)認(rèn)為,RAD001有望作為因頸動(dòng)脈狹窄而導(dǎo)致癡呆的一種輔助治療方法。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R749.13

【參考文獻(xiàn)】

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1 賈建平,賈健民,周衛(wèi)東,徐敏,楚長(zhǎng)彪,閆欣,孫永馨;Differential acetylcholine and choline concentrations in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer’s disease and vascular dementia[J];Chinese Medical Journal;2004年08期

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本文編號(hào)：1574025