本文選題：阿爾茨海默病　切入點(diǎn)：14-3-3β/ζ　出處：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：PP2A活性下降導(dǎo)致tau過(guò)度磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)形成,是阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。核蛋白SET是體內(nèi)PP2A特異、高效的抑制劑,主要分布在嗅球、海馬、大腦皮質(zhì)、尾殼核、丘腦等腦區(qū)。AD患者經(jīng)免疫化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)SET表達(dá)水平明顯增高,而且細(xì)胞定位也從細(xì)胞核轉(zhuǎn)至細(xì)胞漿,并且發(fā)現(xiàn)SET共定位于神經(jīng)元胞漿內(nèi)PP2A及過(guò)度磷酸化的tau蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)SET導(dǎo)致大鼠PP2A活性顯著降低,tau異常過(guò)度磷酸化,神經(jīng)元退變,甚至出現(xiàn)AD患者樣運(yùn)動(dòng)功能障礙的表現(xiàn)。上述研究結(jié)果說(shuō)明：作為PP2A上游調(diào)節(jié)因子,SET在AD腦內(nèi)自核轉(zhuǎn)運(yùn)并滯留于胞漿聚集是引起AD發(fā)病的一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。因此,明確AD腦內(nèi)SET核運(yùn)輸?shù)木唧w機(jī)理將有助于詮釋AD的發(fā)病機(jī)制。然而SET如何轉(zhuǎn)運(yùn)并聚積于胞漿內(nèi),以及PP2A活性被SET所抑制的具體分子機(jī)制尚不清楚。我們前期針對(duì)SET核運(yùn)輸相關(guān)的核定位信號(hào)(Nuclear localization signal, NLS)序列展開(kāi)了相應(yīng)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ser-9位點(diǎn)磷酸化失活SET核定位信號(hào),造成核輸入蛋白不能正常結(jié)合SET,導(dǎo)致SET滯留胞漿。然而,AD患者腦內(nèi)SET Ser-9磷酸化的分子機(jī)制及其它可能致SET滯留胞漿聚集的機(jī)制有待進(jìn)一步明確。14-3-3蛋白作為接頭／支架蛋白與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,廣泛參與了細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等重要生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)進(jìn)程。近來(lái)更多的研究揭示了14-3-3蛋白在核運(yùn)輸中的調(diào)控作用。比如Cdc25蛋白的Ser-216被磷酸化后可以與14-3-3ε結(jié)合形成Cdc25/14-3-3s復(fù)合物,并導(dǎo)致Cdc25不能結(jié)合importina正常進(jìn)入到細(xì)胞核中,類(lèi)似的還有RSG, HDAC4蛋白等。這些研究均提示：14-3-3蛋白對(duì)于核-漿穿梭蛋白的核輸入具有負(fù)調(diào)作用。同時(shí),14-3-3β/ζ在AD患者腦內(nèi)過(guò)表達(dá),存在于NTFs中,與AD患病進(jìn)程正相關(guān)。這些研究提示：14-3-3β/ζ蛋白參與了AD的病理過(guò)程,但具體機(jī)制不明。具有核輸入負(fù)調(diào)作用的14-3-3蛋白與其靶蛋白結(jié)合存在識(shí)別序列RX1-2SX2-3S(X代表基本氨基酸),通過(guò)篩選SET的全長(zhǎng),我們發(fā)現(xiàn)其1‘‘NESGDPSSKST156序列,符合14-3-3蛋白識(shí)別序列RX1-2SX2-3S,提示：14-3-3蛋白可能通過(guò)結(jié)合SET導(dǎo)致其滯留胞漿,抑制PP2A活性,參與AD發(fā)病。本研究證實(shí)：14-3-3通過(guò)與核輸入蛋白importina競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SET,導(dǎo)致核輸入復(fù)合物形成障礙,SET入核困難而滯留胞漿,進(jìn)而引起AD下游病理事件。 目的：探討過(guò)表達(dá)14-3-3β/ζ對(duì)SET核運(yùn)輸障礙的影響及其潛在的分子機(jī)制,為AD藥物開(kāi)發(fā)提供有效的分子靶點(diǎn)。 方法：培養(yǎng)HEK293/tau細(xì)胞,轉(zhuǎn)染表達(dá)14-3-3β/ζ48h后通過(guò)共聚焦／雙光子顯微鏡和WB檢測(cè)SET的亞細(xì)胞分布。通過(guò)Co-IP方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)14-3-3β/ζ組SET與14-3-3β/ζ及核輸入蛋白Importina的結(jié)合程度。通過(guò)篩選SET全長(zhǎng),我們發(fā)現(xiàn)其146NESGDPSSKST156序列,符合14-3-3蛋白識(shí)別序列RX1-2SX2-3S,為此,合成具有穿膜和透血腦屏障功能的純化Tat肽段Tat-NESGDPSSKST(Peptide1),和亂序序列作為對(duì)照的Tat肽段Tat-NSSTEDGPKSS(Peptide2)。在HEK293/tau細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)14-3-3ζ的同時(shí)加入人工合成并純化Tat肽段,48h后通過(guò)共聚焦／雙光子顯微鏡和WB檢測(cè)SET的亞細(xì)胞分布。通過(guò)Co-IP方法檢測(cè)加入Peptide1/2組是否影響SET與14-3-3p/ζ及核輸入蛋白Importina的結(jié)合。通過(guò)PP2A活性檢測(cè)試劑盒(Promega, Cat.#V2460)測(cè)定過(guò)表達(dá)14-3-3β/ξ及Peptide1/2干預(yù)后對(duì)PP2A活性的影響。利用免疫印跡方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)14-3-3β/ζ,SET,14-3-3β/ζ+SET后對(duì)tau蛋白Ser199, Ser202, Thr205,Thr231,Ser262,Ser396和Ser404位點(diǎn)磷酸化程度的影響；人工包裝過(guò)表達(dá)14-3-3ζ的腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV),通過(guò)腺相關(guān)投遞系統(tǒng)感染C57小鼠,分別用Peptide1/2干預(yù),進(jìn)一步明確SET與14-3-3蛋白的結(jié)合序列NESGDPSSKST,確定其可能成為促進(jìn)SET入核的小分子肽,為AD有些藥物開(kāi)發(fā)提供候選分子靶點(diǎn)。通過(guò)條件恐懼實(shí)驗(yàn),水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)行為學(xué)的變化,激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片上SET蛋白的亞細(xì)胞定位。64位陣列系統(tǒng)檢測(cè)活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化,體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元檢測(cè)神經(jīng)元樹(shù)突,樹(shù)突棘等的變化,免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠海馬synaptotagmin,synaptophysin, synapsin1, phosphorylated synapsin1(p-synapsin1), NR1, NR2A和NR2B等突觸蛋白及SET Ser-9磷酸化的變化。 結(jié)果：在HEK293/tau細(xì)胞株中,分別過(guò)表達(dá)14-3-3β/ζ導(dǎo)致大部分SET自核轉(zhuǎn)運(yùn)并滯留于胞漿。分別分離提取胞漿及胞核蛋白后,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3β/ζ組細(xì)胞核內(nèi)的SET蛋白量明顯減少,而在胞漿中明顯增加；通過(guò)免疫共沉淀方法檢測(cè)到過(guò)表達(dá)14-3-3β/ζ；后SET與importina結(jié)合減少導(dǎo)致SET核輸入障礙。我們還觀察到在轉(zhuǎn)染了14-3-3ζ的HEK293/tau細(xì)胞株中,用Peptide1處理導(dǎo)致SET正常轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中。利用核蛋白提取試劑盒分離提取胞漿與胞核蛋白,發(fā)現(xiàn)核蛋白中Peptide1處理組的SET量明顯增高,而在胞漿蛋白中明顯減少；通過(guò)免疫共沉淀方法檢測(cè)到Peptide1處理組SET與importina結(jié)合隨劑量逐漸增加。我們還觀察到過(guò)表達(dá)14-3-3β/ζ后顯著抑制PP2A活性,并導(dǎo)致tau蛋白在Ser199, Ser202, Thr205, Thr231, Ser262, Ser396和Ser404位點(diǎn)發(fā)生過(guò)度磷酸化,Peptide1處理可恢復(fù)PP2A活性。進(jìn)一步在小鼠海馬齒狀回(Dentategyrus,DG)定位注射AAV8-14-3-3ζ病毒感染動(dòng)物,并用Peptide1/2干預(yù),發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3ζ后,小鼠情景恐懼實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶的障礙,而Peptide1處理可以有效恢復(fù)。激光共聚集熒光顯微鏡下觀察到腦片中不同區(qū)域Peptide1可以恢復(fù)過(guò)表達(dá)14-3-3ζ引起的SET胞漿滯留現(xiàn)象。64位陣列系統(tǒng)檢測(cè)活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3ζ可以顯著抑制LTP,而Peptide1處理可以有效恢復(fù),體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3ζ可導(dǎo)致神經(jīng)元樹(shù)突長(zhǎng)度縮短,分支減少,樹(shù)突棘密度減少等變化,而Peptide1處理可以有效恢復(fù),免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在小鼠海馬蛋白中,過(guò)表達(dá)14-3-3ζ可導(dǎo)致synaptotagmin,synaptophysin,synapsin1,phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突觸前蛋白減少,NR2A：NR2B比值變大,SET Ser-9,顯著磷酸化,Peptide1處理可以有效恢復(fù)上述變化。 結(jié)論：14-3-3β/ζ可以通過(guò)與SET蛋白的HESGDPSSKST序列結(jié)合,導(dǎo)致SET與importina結(jié)合顯著減少,從而引起SET核輸入障礙,滯留胞漿,顯著抑制PP2A活性,并導(dǎo)致tau蛋白發(fā)生過(guò)度磷酸化,神經(jīng)元樹(shù)突損傷,LTP及學(xué)習(xí)和記憶的損傷。通過(guò)給予Tat-NESGDPSSKST肽段可以通過(guò)有效競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合14-3-3β/ζ來(lái)釋放SET,使SET核輸入正常而主要定位與胞核,減少對(duì)胞漿中PP2A的抑制,恢復(fù)PP2A活性,減少神經(jīng)元樹(shù)突損傷,恢復(fù)LTP及學(xué)習(xí)和記憶的損傷等。 背景：第一部分研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)14-3-3ζ導(dǎo)致SET滯留在胞漿,并伴有SET Ser-9磷酸化現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)SET上游蛋白激酶CKⅡ在AD腦內(nèi)上調(diào),二聚體的14-3-3ζ可募集CKⅡ。為此,我們?cè)O(shè)想：14-3-3ζ在結(jié)合SET的同時(shí),也俘獲CKⅡ,從而使得SET更容易成為CKⅡ的底物被磷酸化,進(jìn)一步引起磷酸化SET與importina結(jié)合障礙,導(dǎo)致SET滯留胞漿。 目的：探討14-3-3ζ與CKⅡ介導(dǎo)SET滯留胞漿的分子機(jī)制,進(jìn)一步闡明AD發(fā)病機(jī)制。 方法：通過(guò)海馬DG區(qū)注射AAV8-14-3-3ζ病毒,感染C57小鼠,激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片SET的亞細(xì)胞定位,以及SET、14-3-3ξ及CKⅡα的分布與共定位。培養(yǎng)HEK293/tau細(xì)胞,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+/14-3-3ζ48h后,通過(guò)免疫共沉淀方法檢測(cè)SET、14-3-3ζ及CKⅡα的結(jié)合程度。使用CKⅡ特異性抑制劑TBB(4,5,6,7-Tetrabromobenzotriazole)處理轉(zhuǎn)染14-3-3ζ的HEK293/tau細(xì)胞,檢測(cè)SET Ser-9磷酸化變化,SET表達(dá)量變化,CKⅡα表達(dá)量變化。已轉(zhuǎn)染CKⅡα的HEK293/tau細(xì)胞給予sil4-3-3ζ處理,檢測(cè)SET Ser-9磷酸化變化,SET表達(dá)量變化,CKⅡα表達(dá)量變化。通過(guò)絲氨酸／蘇氨酸檢測(cè)試劑盒(Promega,Cat.#V2460)測(cè)定PP2A活性。人工包裝過(guò)表達(dá)CKⅡα的AAV病毒感染C57小鼠,同時(shí)分別用AAV8-si14-3-3ζ、AAV8-Ssi處理。通過(guò)條件恐懼實(shí)驗(yàn),水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)行為學(xué)的變化,激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片上SET蛋白的亞細(xì)胞定位。64位陣列系統(tǒng)檢測(cè)活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化,體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元檢測(cè)神經(jīng)元樹(shù)突,樹(shù)突棘等的變化,免疫印跡檢測(cè)小鼠海馬synaptotagmin, synaptophysin, synapsin1,phosphorylated synapsin1O-synapsin1),NRl, NR2A和NR2B等突觸蛋白及SET Ser-9磷酸化的變化。 結(jié)果：過(guò)表達(dá)14-3-3ζ的AAV8病毒感染C57小鼠腦片上,我們可以觀察到SET、CKⅡα、14-3-3ζ三者間可相互共定位,且過(guò)表達(dá)14-3-3ζ動(dòng)物腦內(nèi)SET主要定位于胞漿。在HEK293/tau細(xì)胞株中,免疫共沉淀結(jié)果顯示SET、CKⅡα、14-3-3ζ三者間相互結(jié)合,且過(guò)表達(dá)14-3-3ζ組的結(jié)合程度顯著增強(qiáng)。這些結(jié)果提示：14-3-3在結(jié)合SET的同時(shí),也可募集CKⅡα。已轉(zhuǎn)染14-3-3ζ的HEK293/tau細(xì)胞給予CKⅡ抑制劑TBB處理后發(fā)現(xiàn),SET Ser-9磷酸化程度顯著降低；給予si14-3-3ζ處理后發(fā)現(xiàn),敲減14-3-3ζ可導(dǎo)致SETSer-9磷酸化程度降低。說(shuō)明CKⅡα通過(guò)14-3-3ζ的募集促進(jìn)對(duì)SET的磷酸化修飾。PP2A活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TBB處理可很好的恢復(fù)由于14-3-3ζ引起的PP2A活性降低。人工包裝過(guò)表達(dá)CKIIa的AAV8病毒感染C57小鼠,同時(shí)分別用AAV8-si14-3-3ξ、AAV8-Ssi處理,條件恐懼、水迷宮實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)si14-3-3ξ處理可恢復(fù)小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。激光共聚集熒光顯微鏡下可觀察到過(guò)表達(dá)CKⅡα可促進(jìn)SET滯留于胞漿,而si14-3-3ζ可恢復(fù)SET的核輸入。64位陣列系統(tǒng)檢測(cè)活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CKⅡα可以顯著抑制LTP,體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CKⅡα可導(dǎo)致神經(jīng)元樹(shù)突長(zhǎng)度縮短,分支減少,樹(shù)突棘密度減少等變化；免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在小鼠海馬蛋白中,過(guò)表達(dá)CKⅡα可導(dǎo)致synaptotagmin, synaptophysin, synapsin1, phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突觸前蛋白減少,NR2A：NR2B比值變大,SET Ser-9顯著磷酸化,si14-3-3ζ處理可以有效恢復(fù)上述變化。 結(jié)論：14-3-3ζ可同時(shí)結(jié)合CKⅡα與SET,并促進(jìn)CKⅡα對(duì)SET Ser-9的磷酸化,進(jìn)一步導(dǎo)致SET滯留胞漿,引起PP2A活性抑制、神經(jīng)元樹(shù)突損傷、學(xué)習(xí)和記憶的損傷。si14-3-3ζ顯著減少CKⅡα與SET的結(jié)合,引起CKⅡ磷酸化SET Ser-9程度降低,從而恢復(fù)PP2A活性、神經(jīng)元樹(shù)突損傷、學(xué)習(xí)和記憶的損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1556900