本文關(guān)鍵詞： 環(huán)孢素A 淀粉樣蛋白 阿爾茨海默病 自噬　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：阿爾茨海默�。ˋlzheimer's disease, AD）是老齡人群中最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴(yán)重?fù)p害患者的認(rèn)知功能。隨著社會(huì)人口老齡化的不斷加劇，AD的防治已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)峻的社會(huì)問題。目前，對(duì)于AD尚沒有理想的治療方法，尋求有效的治療藥物成為研究者的努力方向之一。大量研究表明，β-淀粉樣蛋白（Amyloid-β, Aβ）在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的聚集和沉積是導(dǎo)致患者腦內(nèi)神經(jīng)元變性、丟失乃至形成癡呆的關(guān)鍵因素。因此，很多研究致力于開發(fā)干擾Aβ合成和沉積的藥物類型。目前，通過提高自噬（Autophagy）活性促進(jìn)Aβ清除的方法逐漸成為研究熱點(diǎn)。自噬是溶酶體對(duì)受損細(xì)胞器和老化、毒性蛋白進(jìn)行吞噬降解的一種主動(dòng)清除方式，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和行使正常生理功能起著積極的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者及動(dòng)物模型中，存在自噬水平的降低，可能與AD的發(fā)病有關(guān)。適度提高自噬溶酶體途徑（autophagic lysosomal system，ALP）的活性，可以加速有聚集傾向的蛋白的降解，有可能對(duì)Aβ等蛋白沉積引起的神經(jīng)退行性疾病如AD起到治療作用。很多研究表明環(huán)孢素A(Cyclosporin A, CsA)具有神經(jīng)保護(hù)作用，，而且近期有文獻(xiàn)報(bào)道CsA能夠在大鼠腦細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬，但是尚未見報(bào)道CsA對(duì)AD有無保護(hù)作用，對(duì)自噬水平有何影響。我們利用Aβ25-35干預(yù)PC12細(xì)胞24h建立AD的體外細(xì)胞模型，觀察不同濃度CsA對(duì)受損PC12細(xì)胞的活力及代謝狀態(tài)、存活率以及形態(tài)學(xué)的影響，并觀察CsA對(duì)受損PC12細(xì)胞的保護(hù)作用是否與自噬通路相關(guān)。 方法：（1）PC12細(xì)胞株使用含10%胎牛血清、5%馬血清、100ng/L鏈霉素、0.1U/L青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）分別給予0μM、10μM、20μM、30μM的Aβ25-35干預(yù)PC12細(xì)胞24h后，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，以判斷不同濃度Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞的損傷程度，并選取適合濃度（20μM）的Aβ25-35干預(yù)PC12細(xì)胞，建立AD的體外細(xì)胞模型。使用0.1μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM環(huán)孢素A（CsA）對(duì)PC12細(xì)胞預(yù)處理24h后，給予20μM的Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)24h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力及代謝狀態(tài)，從中選取CsA的有效保護(hù)劑量(0.5μM)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組、0.5μM CsA預(yù)處理組，分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：①光鏡下觀察各組PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。②Hoechst33258/碘化丙啶（propidiumiodide，PI）雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率。③免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞LC3的表達(dá)，觀察自噬活性的變化。 結(jié)果：（1）AD模型的建立：給予PC12細(xì)胞不同劑量Aβ25-35處理后進(jìn)行MTT檢測(cè)，結(jié)果顯示Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞具有損傷作用，且呈劑量依賴性。其中，20μM Aβ和30μM Aβ組與對(duì)照組相比，光密度值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000; P=0.000），本實(shí)驗(yàn)選擇20μM Aβ對(duì)PC12細(xì)胞處理作為AD的體外細(xì)胞模型。（2）CsA有效劑量的選擇：給予各組PC12細(xì)胞相應(yīng)處理后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處的光密度值。模型組細(xì)胞光密度值較空白組明顯降低（P＜0.001），與前實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符；0.5μM CsA預(yù)處理的PC12細(xì)胞光密度值與Aβ25-35處理組相比明顯增高（P＜0.05）。而0.1μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM CsA預(yù)處理組對(duì)PC12細(xì)胞活力及代謝狀態(tài)無明顯改善作用（P＞0.05）。因此，選取0.5μM CsA預(yù)處理PC12細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（3）CsA對(duì)Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞形態(tài)的影響：正常對(duì)照組的PC12細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，胞體飽滿、明亮，突起伸展充分，貼壁良好。模型組細(xì)胞狀態(tài)明顯變差，胞體變暗，突起短小，視野內(nèi)可見大量脫落的細(xì)胞碎片。而0.5μM CsA預(yù)處理組的PC12細(xì)胞狀態(tài)與單純Aβ組相比有明顯改善，貼壁良好，突起較長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)較完整，細(xì)胞碎片少見。（4）CsA對(duì)AD模型細(xì)胞存活率的影響：空白對(duì)照組細(xì)胞存活率最高，20μM Aβ25-35處理組細(xì)胞存活率較對(duì)照組明顯降低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.007)；0.5μM CsA預(yù)處理的PC12細(xì)胞存活率較單純Aβ組有明顯改善，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.012)。（5）CsA對(duì)模型組細(xì)胞自噬活性的影響：對(duì)照組PC12細(xì)胞LC3熒光較強(qiáng)，范圍涵蓋胞核以外的整個(gè)胞體；模型組細(xì)胞LC3熒光強(qiáng)度較正常組細(xì)胞明顯減弱，大部分細(xì)胞未見陽性染色，少數(shù)細(xì)胞LC3陽性區(qū)域僅出現(xiàn)于核周。0.5μMCsA預(yù)處理組細(xì)胞整體熒光強(qiáng)度高于Aβ處理組，且陽性區(qū)域更廣，少見陰性細(xì)胞。 結(jié)論:（1）20μMAβ25-35處理PC12細(xì)胞24h可造成明顯的細(xì)胞損傷，細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，部分細(xì)胞死亡。（2）0.5μMCsA預(yù)處理24h可明顯減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，改善細(xì)胞的活力及代謝狀態(tài)，提高細(xì)胞存活率。（3）CsA對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其提高細(xì)胞的自噬活性有關(guān)。
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本文編號(hào)：1496573