本文關鍵詞：TDP-43與β-淀粉樣前體蛋白胞內(nèi)結構域相互作用并誘導P53依賴的細胞凋亡　出處：《蘇州大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的： 探求TDP-43(TAR DNA-binding protein43)與β-淀粉樣前體蛋白胞內(nèi)結構域（the intracellular domain of Amyloid Precursor Protein，AICD）之間的關系，從而揭示其在阿爾茨海默病病理機制中可能發(fā)揮的作用。 方法： 1.運用免疫熒光染色方法在HEK293/COS7細胞系上檢測TDP-43與AICD在細胞水平的是否存在共定位。2.在細胞系上轉(zhuǎn)染克隆質(zhì)粒TDP-43-V5、APP-FLAG，，48h后收集細胞提取蛋白，用免疫共沉淀（co-immunoprecipitations）的方法檢測APP（β淀粉樣蛋白前體蛋白）與TDP-43在蛋白水平是否結合。在野生型C57/BL6J成年小鼠的大腦組織上用免疫共沉淀方法證明內(nèi)源性的TDP-43與APP在正常小鼠腦組織中是否存在結合關系。進一步在細胞系上轉(zhuǎn)染質(zhì)粒TDP-43-V5、AICD-FLAG，以明確TDP-43是否與AICD存在結合關系。3.用雙熒光素酶報告基因測試方法檢測TDP-43對AICD是否存在轉(zhuǎn)錄作用，進一步加入APP γ酶切位點的分泌酶抑制劑，觀察這種轉(zhuǎn)錄作用是否有變化。用Real-Time PCR的方法檢測這種轉(zhuǎn)錄作用對P53mRNA水平的影響。4.在分別轉(zhuǎn)染了AICD，TDP-43，AICD+TDP-43的細胞系上計數(shù)Caspase-3陽性細胞，直接比較對細胞凋亡的作用。使用TUNEL法再次重復實驗。 結果： 1.免疫熒光染色，觀察到在體外培養(yǎng)的HEK293/COS7細胞系上，TDP-43在細胞水平定位于胞核，AICD大部分位于胞核，且二者存在共定位關系。2.在細胞系上轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，進一步證明了TDP-43與AICD在蛋白水平存在結合。在野生型C57/BL6J成年小鼠的大腦組織上檢測到內(nèi)源性的TDP-43與AICD存在結合。3.TDP-43對AICD有類似于Fe65樣的轉(zhuǎn)錄激活作用，但是這種作用可以被加入的APPγ酶切位點的分泌酶抑制劑所阻斷（***p0.001；NS：無意義）。TDP-43有類似與AICD的作用，增加P53mRNA的表達水平，從而促進TP53基因編碼的P53蛋白的轉(zhuǎn)錄作用，且TDP-43可以增強AICD該種轉(zhuǎn)錄激活作用（*：p 0.05；**: p 0.01；***p 0.001）。4. TDP-43在誘導細胞凋亡方面有與AICD類似的作用，其增加Caspase-3陽性或TUNEL陽性細胞數(shù)，促進細胞凋亡；并且TDP-43可以增強AICD誘導細胞凋亡的作用（*：p 0.05；**：p 0.01；***：p 0.001）。 結論： TDP-43與AICD共定位存在與細胞核中；TDP-43增強AICD的轉(zhuǎn)錄作用，以及ACID對P53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；TDP-43促進AICD介導的細胞凋亡。因此，通過我們的研究結果可以設想，TDP-43可能為阿爾茨海默病研究的新靶點。阿爾茨海默病相關病理組織的萎縮可能與TDP-43調(diào)控的APP信號通路有相關性。
[Abstract]:Objective: Study on the relationship between TDP-43(TAR DNA-binding protein 43 and 尾 -amyloid precursor protein (尾 -amyloid precursor protein). The intracellular domain of Amyloid Precursor Protein. The relationship between AICD, thus revealing its possible role in the pathological mechanism of Alzheimer's disease. Methods: 1. Immunofluorescence staining was used to detect the co-localization of TDP-43 and AICD in HEK293/COS7 cell line. 2. Transfection of cloned plasmid T. DP-43-V5. After 48 hours of APP-FLAGG, the protein extracted from the cells was collected. Detection of app (尾 -amyloid precursor protein) by co-immunoprecipitation with co-immunoprecipitation. The immunoprecipitation method was used to prove that endogenous TDP-43 and APP were present in the brain of normal C57 / BL6J adult mice by immunoprecipitation. Further transfection of plasmid TDP-43-V5 on cell line was carried out. AICD-FLAG. To determine the binding relationship between TDP-43 and AICD. 3. To detect whether TDP-43 has transcriptional effect on AICD by double luciferase reporter gene test. The secretory enzyme inhibitor of APP 緯 restriction site was added further. Real-Time PCR was used to detect the effect of transcription on p53 mRNA level. 4. AICD was transfected respectively. Caspase-3 positive cells were counted on the cell line of TDP-43 AICD TDP-43, and the effect on apoptosis was compared directly. TUNEL method was used to repeat the experiment. Results: 1. Immunofluorescence staining showed that TDP-43 was located mostly in the nucleus of HEK293/COS7 cell line at the cellular level. And there is a colocalization relationship between them. 2. Transfection plasmid on cell line. It was further demonstrated that TDP-43 and AICD bind to protein level. Endogenous TDP-43 and AICD knots were detected in the brain tissues of wild-type C57 / BL6J adult mice. The transcriptional activation of AICD by TDP-43 is similar to that of Fe65. However, this effect could be blocked by the addition of secretory enzyme inhibitor at APP 緯 site. NS.TDP-43 has similar effect with AICD and increases the expression level of p53 mRNA, thus promoting the transcription of p53 protein encoded by TP53 gene. TDP-43 could enhance the transcriptional activation of AICD. P0.01; TDP-43 has similar effect as AICD in inducing apoptosis, which increases the number of Caspase-3 positive cells or TUNEL positive cells. Promoting apoptosis; TDP-43 could enhance the apoptosis induced by AICD. P0.01; A: P 0.001. Conclusion: TDP-43 and AICD co-located in the nucleus; TDP-43 enhanced the transcription of AICD and the transcriptional regulation of p53 by ACID. TDP-43 promotes apoptosis mediated by AICD. Therefore, through our research results, we can imagine. TDP-43 may be a new target for the study of Alzheimer's disease. The atrophy of Alzheimer's disease-related tissues may be related to the APP signaling pathway regulated by TDP-43.
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16

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本文編號：1396567