發(fā)布時(shí)間：2018-01-08 15:07

  本文關(guān)鍵詞：NLRP3炎性小體在抑郁樣行為中的作用及分子機(jī)制　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 應(yīng)激 抑郁癥 炎性因子 NLRP3炎性小體 IL-1β 活性氧ROS

【摘要】：研究背景隨著社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的日益激烈,工作和生活節(jié)奏越來越快,人們所承受的壓力和挑戰(zhàn)變得越來越多,即大家每天暴露于日常生活應(yīng)激的頻率和強(qiáng)度都愈來愈大。持續(xù)、過強(qiáng)的應(yīng)激嚴(yán)重地影響著我們的身心健康,并可能會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重危害人類身心健康的應(yīng)激相關(guān)性疾病。應(yīng)激已經(jīng)成為人類多種重大疾病的重要病因和誘因,而且越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道其與抑郁癥發(fā)病的關(guān)系尤為密切。抑郁癥以顯著而持久的心境低落或?qū)Ω鞣N日�；顒�(dòng)的興趣缺失為主要特征,因其高發(fā)性、高致殘性以及對(duì)家庭和社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)而引起人們的高度重視,抑郁癥目前已經(jīng)是導(dǎo)致全球疾病負(fù)擔(dān)的一個(gè)重大因素。全球約有超過3.5億人患有抑郁癥,美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家抑郁癥患病率較高,我國(guó)抑郁癥的發(fā)病率約為3%-5%,老年人群抑郁癥患病率較高,癌癥患者抑郁癥患病率明顯升高。因此,對(duì)應(yīng)激導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究,繼而為抗抑郁藥的開發(fā)和臨床應(yīng)用,以及探尋有效的防治策略具有非常重要的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)意義。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,然而迄今為止具體機(jī)制仍不清楚。目前主要有神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說、神經(jīng)回路學(xué)說等,這些學(xué)說認(rèn)為抑郁癥主要是由于腦內(nèi)去甲腎上腺素、膽堿、5-羥色胺和多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)失衡及下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂所致。同時(shí)近幾十年來細(xì)胞因子學(xué)說在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中受到越來越多研究者的關(guān)注。細(xì)胞因子學(xué)說也稱炎性反應(yīng)學(xué)說,是基于抑郁癥患者存在免疫學(xué)的改變而提出的,該學(xué)說認(rèn)為過度活化的免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。目前細(xì)胞因子學(xué)說已有系列臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果予以證實(shí),因而抗炎治療也逐漸成為抑郁癥防治新的研究方向。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子參與抑郁癥的發(fā)生,白細(xì)胞介素-1b(IL-1b)在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要的角色,其與應(yīng)激所致的情緒、行為異常等密切相關(guān)。IL-1b前體的剪切成熟需要IL-1b轉(zhuǎn)化酶,而IL-1b轉(zhuǎn)化酶是一種多蛋白復(fù)合體-炎性小體的重要組分。炎性小體由于其在固有免疫系統(tǒng)免疫功能的發(fā)揮及一系列炎癥性疾病的發(fā)生機(jī)制中舉足輕重的作用受到了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。NLRP3炎性小體是目前研究的較為深入的炎性小體之一,其由NOD樣受體、接頭蛋白ASC和效應(yīng)蛋白Caspase-1(即IL-1b轉(zhuǎn)化酶)組成,能夠促進(jìn)IL-1b、IL-18和IL-33的剪切與成熟。NLRP3炎性小體可被感染、活性氧ROS、損傷及代謝產(chǎn)物、三磷酸腺苷ATP等多種外源性或內(nèi)源性應(yīng)激因素激活。國(guó)外研究者綜述抑郁癥發(fā)病的炎性機(jī)制相關(guān)文獻(xiàn)后提出,NLRP3炎性小體可能在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中扮演重要作用,但NLRP3炎性小體是否及如何參與抑郁癥發(fā)生的分子機(jī)制并不清楚,包括NLRP3炎性小體激活的上下游信號(hào)通路,以及NLRP3炎性小體激活的靶組織和靶細(xì)胞等。而且,應(yīng)激能否激活NLRP3炎性小體導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生也未見文獻(xiàn)報(bào)道的直接證據(jù)。深入研究應(yīng)激因素如何活化NLRP3炎性小體進(jìn)而誘導(dǎo)抑郁癥發(fā)生的分子機(jī)制,不僅有利于闡釋抑郁癥的發(fā)病機(jī)制,還有助于為其它應(yīng)激性疾病的防治提供新的思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究目的本課題通過構(gòu)建急、慢性小鼠抑郁癥模型,擬證實(shí)NLRP3炎性小體是脂多糖(LPS)和應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一,初步闡明應(yīng)激激活NLRP3炎性小體可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和分子機(jī)制,并探究抑郁癥干預(yù)新的靶點(diǎn),為抑郁癥等應(yīng)激性疾病的防治提供新策略。首先,觀察急、慢性小鼠抑郁癥模型中NLRP3炎性小體是否激活。通過免疫蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NLRP3炎性小體蛋白表達(dá)、實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NLRP3炎性小體m RNA表達(dá),以及通過免疫熒光雙標(biāo)定位NLRP3炎性小體在腦內(nèi)激活的靶細(xì)胞等。其次,研究NLRP3炎性小體在抑郁癥模型中的作用。給予NLRP3炎性小體抑制劑抑制NLRP3炎性小體活性后,檢測(cè)NLRP3炎性小體信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,并通過行為學(xué)指標(biāo)觀察模型小鼠抑郁樣行為能否得以改善。最后,探索LPS和應(yīng)激激活NLRP3炎性小體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。通過檢測(cè)LPS和應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁癥動(dòng)物模型腦組織中活性氧ROS生成、P2X7受體及NF-κB蛋白的表達(dá)變化等,以及用富氫水阻斷活性氧ROS生成后,NLRP3炎性小體通路蛋白的表達(dá)變化,以探索NLRP3炎性小體的激活途徑。研究方法動(dòng)物模型:利用LPS和慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)建立急、慢性小鼠抑郁癥模型,通過檢測(cè)抑郁樣行為指標(biāo),包括糖水偏愛實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)等,檢驗(yàn)動(dòng)物模型造模成功與否。NLRP3炎性小體通路抑制劑:NLRP3炎性小體通路上游靶點(diǎn)的抑制劑如ROS生成抑制劑富氫水,下游靶點(diǎn)IL-1b轉(zhuǎn)化酶Caspase-1的特異性拮抗劑YVAD和VX-765。NLRP3炎性小體的表達(dá):免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)NLRP3炎性小體的蛋白和m RNA的表達(dá)變化。炎性細(xì)胞因子檢測(cè):通過高通量蛋白懸液芯片法和酶聯(lián)免疫吸附法等檢測(cè)LPS和應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-1b、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等的表達(dá)水平。信號(hào)通路分子檢測(cè):通過高通量檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)等,檢測(cè)活性氧ROS、P2X7受體以及NF-kB炎性通路等關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化。研究結(jié)果(一)NLRP3炎性小體參與急性抑郁癥1、通過糖水偏愛實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察LPS誘導(dǎo)的小鼠行為變化,腹腔給予脂多糖24小時(shí)后小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。2、通過蛋白懸液芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的抑郁樣行為小鼠腦內(nèi)IL-1b蛋白和m RNA表達(dá)水平,二者均明顯升高。3、檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的抑郁樣行為小鼠腦中NLRP3炎性小體各組分的m RNA表達(dá)水平,NLRP3、ASC和Caspase-1表達(dá)水平均明顯升高。4、小鼠腹腔注射LPS半小時(shí)前予以腹腔注射NLRP3炎性小體特異性阻斷劑YVAD,通過糖水偏愛實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為變化,NLRP3炎性小體特異性阻斷劑YVAD可以顯著減輕抑郁樣行為。(二)NLRP3炎性小體參與慢性抑郁癥1、通過糖水偏愛和懸尾實(shí)驗(yàn)觀察到,CUMS四周后小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。2、通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血清皮質(zhì)酮水平、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-1b蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)應(yīng)激四周后皮質(zhì)酮水平顯著升高,海馬組織中IL-1b的前體明顯減少,而活化的IL-1b顯著增加。3、通過對(duì)IL-1b轉(zhuǎn)化酶Caspase-1活性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)應(yīng)激四周后小鼠海馬中Caspase-1活性明顯增加;通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NLRP3炎性小體其他兩個(gè)組分NLRP3和ASC的表達(dá)水平也明顯增加。4、在慢性應(yīng)激刺激的同時(shí),每天給予小鼠腹腔注射NLRP3炎性小體特異性拮抗劑VX-765,四周后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)應(yīng)激所致的Caspase-1活性增加得到了顯著抑制,NLRP3和ASC的蛋白表達(dá)水平也明顯下降。5、通過蛋白懸液芯片技術(shù)檢測(cè)血清和海馬中IL-1b水平發(fā)現(xiàn),給予NLRP3炎性小體特異性抑制劑VX-765能明顯抑制應(yīng)激所致的IL-1b蛋白表達(dá)升高,同時(shí)糖水偏愛實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)也表明小鼠抑郁樣行為得到明顯改善。(三)富氫水可預(yù)防慢性抑郁癥1、在慢性應(yīng)激刺激的同時(shí),每天給小鼠飲用富氫水,通過糖水偏愛和懸尾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),應(yīng)激所致的抑郁樣行為得到了明顯改善,而且富氫水明顯緩解了應(yīng)激所致的體重減輕。2、通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠海馬和皮層IL-1b蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),富氫水可以顯著抑制應(yīng)激所致的IL-1b蛋白表達(dá)升高。3、通過IL-1b轉(zhuǎn)化酶Caspase-1激活熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn),慢性應(yīng)激四周后小鼠海馬和前額葉皮層Caspase-1均明顯激活,而富氫水可以顯著抑制應(yīng)激所致的Caspase-1激活。4、通過活性氧ROS檢測(cè)發(fā)現(xiàn),慢性應(yīng)激四周后小鼠海馬和前額葉皮層ROS生成均明顯增加,而富氫水可以顯著抑制應(yīng)激所致的ROS生成。結(jié)論NLRP3炎性小體通過IL-1通路在LPS和慢性應(yīng)激所致的抑郁樣行為中發(fā)揮重要作用,NLRP3炎性小體抑制劑和富氫水可以明顯改善模型動(dòng)物的抑郁樣行為。
[Abstract]:In recent decades , the pathogenesis of depression has become a major factor in depression . The pathogenesis of depression has been a major factor in the pathogenesis of depression . In order to study the expression of NLRP3 inflammatory small body , the expression of NLRP3 inflammatory small body in depression was investigated . The levels of IL - 1b protein in hippocampus and hippocampus of mice were significantly inhibited by enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.4

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本文編號(hào)：1397587