本文關(guān)鍵詞：抗Aβ單鏈抗體的桿狀病毒表達(dá)及其干預(yù)Aβ體外聚集的機(jī)制研究　出處：《北京交通大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種常見的衰老相關(guān)的癡呆,在全球有3560萬以上的老人患病。β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid peptide, Aβ)的錯(cuò)誤折疊和聚集是AD的主要病理特點(diǎn)之一。通過之前的研究,本實(shí)驗(yàn)室已成功獲得Ap寡聚體偏向的具有潛在治療作用的單克隆抗體A8。為了進(jìn)一步研究其作用機(jī)制,本研究擬構(gòu)建和表達(dá)A8的單鏈抗體(single chain variable fragment, scFv),并研究其對(duì)Aβ聚集-解聚的干預(yù)作用和機(jī)制。 方法：1)scFv的表達(dá)、純化和鑒定。根據(jù)之前克隆得到的A8單抗輕重鏈可變區(qū)序列,設(shè)計(jì)引物,分別在氨基和羧基末端引入組氨酸(His)標(biāo)簽,構(gòu)建重組表達(dá)桿粒；之后通過轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞進(jìn)行scFv的表達(dá),采用鎳親和層析柱進(jìn)行純化；通過Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物和純化蛋白的分子量,通過斑點(diǎn)印跡和間接ELISA等方法對(duì)scFv的抗原識(shí)別能力進(jìn)行初步鑒定。2)構(gòu)建Aβ體外聚集的透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)測試實(shí)驗(yàn)體系。在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣,對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染之后通過TEM對(duì)Ap的聚集情況進(jìn)行測試分析。3)單鏈抗體對(duì)Aβ聚集的雙向干預(yù)。在體外相變模型的體系中,分別研究scFv對(duì)Aβ聚集反應(yīng)的抑制和對(duì)已經(jīng)形成的纖維的降解作用。首先,將Aβ單體與scFv置于選定的反應(yīng)體系中進(jìn)行孵育,分別用反應(yīng)緩沖液和A8單抗做為對(duì)照,觀察與時(shí)間相關(guān)的纖維的形成狀況,研究scFv對(duì)纖維形成的抑制作用。然后,選擇不同的scFv濃度,研究其抑制作用的劑量依賴關(guān)系。最后,在已經(jīng)形成的Aβ纖維樣品(生長48h的纖維)中加入scFv繼續(xù)進(jìn)行孵育,以scFv緩沖液做為對(duì)照,研究scFv對(duì)已經(jīng)形成的纖維的降解作用。 結(jié)果：1)在桿狀病毒體系中,成功表達(dá)和純化了帶有His標(biāo)簽的scFv, Western blot結(jié)果表明其分子量為30kDa左右,與預(yù)期大小一致；斑點(diǎn)印跡和間接ELISA的結(jié)果表明所得scFv能夠識(shí)別Aβ寡聚體抗原。2)確立Aβ體外相變模型并優(yōu)化了其反應(yīng)參數(shù),確定最適合的緩沖液是硼酸緩沖液(pH8.5)；在沒有Aβ預(yù)聚集的情況下,37℃孵育很快就有短纖維形成,約200nm；24h后長度平均約500nm,在孵育48h之后即可形成明顯的較長的Aβ纖維,平均1μm；隨著時(shí)間的推移,纖維的長度和直徑逐漸增加,在96h后會(huì)有纏結(jié)的纖維形成。3)證實(shí)scFv對(duì)Aβ體外聚集的抑制作用。在加入scFv的實(shí)驗(yàn)組中,纖維的長度明顯較同時(shí)間的對(duì)照組更短(p0.01),表明scFv可以有效的抑制纖維的形成。在已形成的纖維中加入scFv后,作用48h,與緩沖液及單抗對(duì)照組相比,長纖維明顯變短(p0.01),提示scFv能夠降解事先形成的纖維。在劑量依賴性研究中,可以看到10倍摩爾比的scFv能夠起到抑制纖維形成的作用(p0.01),而1倍和5倍摩爾比的scFv對(duì)纖維形成的抑制效果并不明顯。 綜上所述,桿狀病毒體系表達(dá)的抗Aβ scFv可以有效的抑制Aβ的聚集并對(duì)已經(jīng)形成的纖維有一定的降解作用,而scFv的作用具有量-效依賴關(guān)系。本研究為進(jìn)一步研究抗體參與的Aβ聚集-解聚的作用機(jī)制及相關(guān)抑制劑的開發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 史寶和;李玉鋒;李成洋;師衛(wèi);陳曉虹;;石杉?jí)A甲治療輕中度阿爾茨海默病的臨床研究[J];實(shí)用藥物與臨床;2013年01期

2 孫禹堯;;阿爾茨海默病中Aβ聚集的研究進(jìn)展[J];中國老年學(xué)雜志;2013年12期

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本文編號(hào)：1333761