發(fā)布時間：2017-12-25 14:45

  本文關鍵詞：羊膜間充質細胞在Aβ激活的小膠質細胞誘導神經(jīng)元凋亡中的免疫調控作用　出處：《蘇州大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)俗稱老年性癡呆(senile dementia)，是老年人中常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)退行性疾病。其病因復雜，多數(shù)研究表明β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein，Aβ)在阿爾茨海默病(AD)中起著重要作用，Aβ作為慢性刺激物質在腦內逐漸沉積形成神經(jīng)炎斑。它可以介導小膠質細胞(microglia，MI)的非特異性局灶性炎性反應，并以此導致神經(jīng)元損傷或死亡�？梢�，Aβ沉積介導的小膠質細胞的激活是導致AD腦內神經(jīng)元丟失的重要原因。 由于AD發(fā)病機制復雜，使其在治療方面存在極大的困難，很多治療AD的化學藥物僅僅能改變疾病的癥狀，卻不能抑制疾病的進展。隨著高新技術的發(fā)展和應用，尤其是干細胞移植技術的不斷完善，給治療AD提供了新的策略和契機。 研究發(fā)現(xiàn)來源于胎膜的羊膜間充質細胞(Amniotic mesenchyme (stem) cells，AMSCs)不僅具有干細胞特性、免疫原性較弱，，本身還具有免疫調節(jié)特性，能夠抑制免疫細胞的增殖而不引起其免疫反應�；贛I在AD中的作用，我們設想羊膜間充質細胞也可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫細胞-MI的過度活化，進而調控由其觸發(fā)的一系列炎癥級聯(lián)反應的發(fā)生，從而起到保護神經(jīng)元細胞的作用。 目的 本實驗旨在研究羊膜間充質細胞的干細胞特性及其對Aβ激活的小膠質細胞的免疫抑制作用，并進一步探討Aβ激活的小膠質細胞經(jīng)羊膜間充質細胞免疫調控后對體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞凋亡的影響。 方法 1．3種細胞的原代培養(yǎng)及鑒定： 采用原代細胞培養(yǎng)技術，進行羊膜間充質細胞、小膠質細胞和神經(jīng)元細胞的分離及培養(yǎng)；然后用免疫熒光標記、流式細胞儀檢測分析其表型和神經(jīng)生物學特性。 2．AMSCs與MI共培養(yǎng)體系的建立： 羊膜間充質細胞與小膠質細胞均調整濃度為1.0×106/ml，實驗中處理組加入10μMAβ1-42。具體分組： (1)空白組：僅接種MI； (2)Aβ激活組：接種MI+Aβ1-42； (3)共培養(yǎng)組：接種AMSCs+MI+Aβ1-42。 96h后觀察細胞的形態(tài)，并用ELISA檢測各組炎性因子TNF-α、IL-6和NO的含量變化。 3．Transwell分層共培養(yǎng)體系的建立： 上室Transwell小室接種小膠質細胞，下室6孔塑料培養(yǎng)板培養(yǎng)神經(jīng)元細胞，實驗中處理組加入10μMAβ1-42。實驗分組如下： (1)空白對照組(control組)：神經(jīng)元細胞正常培養(yǎng)于下室，上室加培養(yǎng)基; (2)Aβ刺激組(神經(jīng)元細胞+Aβ1-42)：神經(jīng)元細胞培養(yǎng)于下室，上室加入終濃度為10μMAβ1-42的培養(yǎng)基; (3) MI刺激組(神經(jīng)元細胞+MI)：神經(jīng)元細胞與小膠質細胞以1:1的濃度比依次接種于下室和上室; (4)Aβ與MI共刺激組(神經(jīng)元細胞+Aβ1-42+MI)：神經(jīng)元細胞與小膠質細胞以1:1的濃度比依次接種于下室和上室，上層小膠質細胞貼壁后加入終濃度為10μM Aβ1-42的培養(yǎng)基。 (5)AMSCs干預共培養(yǎng)組(神經(jīng)元細胞+Aβ1-42+MI+AMSCs)：神經(jīng)元細胞與小膠質細胞以1:1的濃度比依次接種于下室和上室，同時小膠質細胞層加入同等數(shù)量的羊膜間充質細胞，兩種細胞貼壁后再加入終濃度為10μMAβ1-42的培養(yǎng)基。 4．各組細胞經(jīng)處理96h之后（4、5組從加入Aβ后計時），免疫熒光顯微鏡檢測神經(jīng)元的凋亡率：1、用Hoechst33342標記法于免疫熒光顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元的凋亡情況；2、AnnexinV-FITC/PI法檢測：在高倍熒光顯微鏡下隨機選取10個視野，計數(shù)凋亡陽性細胞的個數(shù)，計算凋亡率=凋亡陽性細胞個數(shù)/總細胞個數(shù)。 5．統(tǒng)計學處理：所有統(tǒng)計分析均用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析，P0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。 結果 1.原代培養(yǎng)的AMSCs接種后貼壁生長，流式細胞儀鑒定為高表達CD90、CD105，低表達CD45、HLA-DR，免疫熒光染色示CD200表達陽性；經(jīng)誘導后的AMSCs表達神經(jīng)細胞特異性標記物MAP-2、GFAP； 2．分離培養(yǎng)的MI純化后胞體扁平或卵圓形，突起細長。經(jīng)CD68免疫熒光檢測，陽性率在92%以上； 3．原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞胞體豐滿，突起清晰，神經(jīng)細胞特異性標記物MAP-2免疫熒光鑒定可見陽性細胞胞漿及突起均著色，純度可達到90%； 4．ELISA檢測各組炎性因子TNF-α、IL-6和NO的含量變化： (1)在Aβ的刺激下，MI分泌炎性分子TNF-α、IL-6和NO的量上升（P0.05）； (2)AMSCs共培養(yǎng)組中炎性分子的量與Aβ激活組比較下降（P0.05），但與空白組比較，即使與AMSCs共培養(yǎng)，Aβ仍使TNF-α、IL-6和NO的分泌量升高(P0.05)。 5．AnnexinV-FITC/PI法檢測神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)據(jù)顯示： (1)空白對照組中神經(jīng)元細胞凋亡率為12.08，單純小膠質細胞與神經(jīng)元細胞共培養(yǎng)時凋亡率為13.25，差異不明顯（P0.05）; (2)單純Aβ與神經(jīng)元細胞共培養(yǎng)時凋亡率為19.75，與空白對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P0.01）； (3)Aβ與MI共刺激組與Aβ刺激組比較，可見凋亡率升高至31.46，具有統(tǒng)計學意義（P0.01）; (4)加入AMSCs共培養(yǎng)后可使神經(jīng)元細胞凋亡率降至20.79，雖仍高于空白對照組（P0.01），但與Aβ與MI共刺激組比較凋亡率下降（P0.01）。 結論1．AMSCs來源豐富、擴增能力強、免疫源性低，具有干細胞特性，可誘導分化成神經(jīng)元樣細胞；2．Aβ1-42可激活MI，促使其炎性因子分泌增多，體外培養(yǎng)的羊膜間充質細胞與小膠質細胞共培養(yǎng)后可使后者致炎因子分泌下調； 3．Aβ1-42介導MI的活化對神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡作用，AMSCs可通過負性調節(jié)MI的活化發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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1 陳海云;董萬利;薛壽儒;惠國楨;郭禮和;;人羊膜上皮細胞側腦室移植治療腦出血大鼠實驗研究[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2011年02期

2 張振馨,ZahnerGE,RomanGC,劉君,洪震,屈秋民,劉協(xié)和,張曉君,周玢,武成斌,唐牟尼,洪霞,李輝;中國北京、西安、上海和成都地區(qū)癡呆亞型患病率的研究[J];中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志;2005年03期

3 祖衡兵,陳生弟;補體系統(tǒng)與Alzheimer病(綜述)[J];中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志;2001年01期

4 ;Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells[J];Chinese Medical Sciences Journal;2010年04期

本文編號：1333275