發(fā)布時(shí)間：2017-12-25 14:45

  本文關(guān)鍵詞：羊膜間充質(zhì)細(xì)胞在Aβ激活的小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡中的免疫調(diào)控作用　出處：《蘇州大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)俗稱老年性癡呆(senile dementia)，是老年人中常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)退行性疾病。其病因復(fù)雜，多數(shù)研究表明β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein，Aβ)在阿爾茨海默病(AD)中起著重要作用，Aβ作為慢性刺激物質(zhì)在腦內(nèi)逐漸沉積形成神經(jīng)炎斑。它可以介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MI)的非特異性局灶性炎性反應(yīng)，并以此導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或死亡�？梢�，Aβ沉積介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是導(dǎo)致AD腦內(nèi)神經(jīng)元丟失的重要原因。 由于AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，使其在治療方面存在極大的困難，很多治療AD的化學(xué)藥物僅僅能改變疾病的癥狀，卻不能抑制疾病的進(jìn)展。隨著高新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，尤其是干細(xì)胞移植技術(shù)的不斷完善，給治療AD提供了新的策略和契機(jī)。 研究發(fā)現(xiàn)來源于胎膜的羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(Amniotic mesenchyme (stem) cells，AMSCs)不僅具有干細(xì)胞特性、免疫原性較弱，，本身還具有免疫調(diào)節(jié)特性，能夠抑制免疫細(xì)胞的增殖而不引起其免疫反應(yīng)�；贛I在AD中的作用，我們?cè)O(shè)想羊膜間充質(zhì)細(xì)胞也可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫細(xì)胞-MI的過度活化，進(jìn)而調(diào)控由其觸發(fā)的一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，從而起到保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用。 目的 本實(shí)驗(yàn)旨在研究羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞特性及其對(duì)Aβ激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫抑制作用，并進(jìn)一步探討Aβ激活的小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)羊膜間充質(zhì)細(xì)胞免疫調(diào)控后對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。 方法 1．3種細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定： 采用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，進(jìn)行羊膜間充質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的分離及培養(yǎng)；然后用免疫熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞儀檢測分析其表型和神經(jīng)生物學(xué)特性。 2．AMSCs與MI共培養(yǎng)體系的建立： 羊膜間充質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞均調(diào)整濃度為1.0×106/ml，實(shí)驗(yàn)中處理組加入10μMAβ1-42。具體分組： (1)空白組：僅接種MI； (2)Aβ激活組：接種MI+Aβ1-42； (3)共培養(yǎng)組：接種AMSCs+MI+Aβ1-42。 96h后觀察細(xì)胞的形態(tài)，并用ELISA檢測各組炎性因子TNF-α、IL-6和NO的含量變化。 3．Transwell分層共培養(yǎng)體系的建立： 上室Transwell小室接種小膠質(zhì)細(xì)胞，下室6孔塑料培養(yǎng)板培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中處理組加入10μMAβ1-42。實(shí)驗(yàn)分組如下： (1)空白對(duì)照組(control組)：神經(jīng)元細(xì)胞正常培養(yǎng)于下室，上室加培養(yǎng)基; (2)Aβ刺激組(神經(jīng)元細(xì)胞+Aβ1-42)：神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)于下室，上室加入終濃度為10μMAβ1-42的培養(yǎng)基; (3) MI刺激組(神經(jīng)元細(xì)胞+MI)：神經(jīng)元細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞以1:1的濃度比依次接種于下室和上室; (4)Aβ與MI共刺激組(神經(jīng)元細(xì)胞+Aβ1-42+MI)：神經(jīng)元細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞以1:1的濃度比依次接種于下室和上室，上層小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后加入終濃度為10μM Aβ1-42的培養(yǎng)基。 (5)AMSCs干預(yù)共培養(yǎng)組(神經(jīng)元細(xì)胞+Aβ1-42+MI+AMSCs)：神經(jīng)元細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞以1:1的濃度比依次接種于下室和上室，同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞層加入同等數(shù)量的羊膜間充質(zhì)細(xì)胞，兩種細(xì)胞貼壁后再加入終濃度為10μMAβ1-42的培養(yǎng)基。 4．各組細(xì)胞經(jīng)處理96h之后（4、5組從加入Aβ后計(jì)時(shí)），免疫熒光顯微鏡檢測神經(jīng)元的凋亡率：1、用Hoechst33342標(biāo)記法于免疫熒光顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元的凋亡情況；2、AnnexinV-FITC/PI法檢測：在高倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，計(jì)算凋亡率=凋亡陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)/總細(xì)胞個(gè)數(shù)。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有統(tǒng)計(jì)分析均用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.原代培養(yǎng)的AMSCs接種后貼壁生長，流式細(xì)胞儀鑒定為高表達(dá)CD90、CD105，低表達(dá)CD45、HLA-DR，免疫熒光染色示CD200表達(dá)陽性；經(jīng)誘導(dǎo)后的AMSCs表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物MAP-2、GFAP； 2．分離培養(yǎng)的MI純化后胞體扁平或卵圓形，突起細(xì)長。經(jīng)CD68免疫熒光檢測，陽性率在92%以上； 3．原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞胞體豐滿，突起清晰，神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物MAP-2免疫熒光鑒定可見陽性細(xì)胞胞漿及突起均著色，純度可達(dá)到90%； 4．ELISA檢測各組炎性因子TNF-α、IL-6和NO的含量變化： (1)在Aβ的刺激下，MI分泌炎性分子TNF-α、IL-6和NO的量上升（P0.05）； (2)AMSCs共培養(yǎng)組中炎性分子的量與Aβ激活組比較下降（P0.05），但與空白組比較，即使與AMSCs共培養(yǎng)，Aβ仍使TNF-α、IL-6和NO的分泌量升高(P0.05)。 5．AnnexinV-FITC/PI法檢測神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)顯示： (1)空白對(duì)照組中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率為12.08，單純小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)凋亡率為13.25，差異不明顯（P0.05）; (2)單純Aβ與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)凋亡率為19.75，與空白對(duì)照組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）； (3)Aβ與MI共刺激組與Aβ刺激組比較，可見凋亡率升高至31.46，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）; (4)加入AMSCs共培養(yǎng)后可使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率降至20.79，雖仍高于空白對(duì)照組（P0.01），但與Aβ與MI共刺激組比較凋亡率下降（P0.01）。 結(jié)論1．AMSCs來源豐富、擴(kuò)增能力強(qiáng)、免疫源性低，具有干細(xì)胞特性，可誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞；2．Aβ1-42可激活MI，促使其炎性因子分泌增多，體外培養(yǎng)的羊膜間充質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后可使后者致炎因子分泌下調(diào)； 3．Aβ1-42介導(dǎo)MI的活化對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡作用，AMSCs可通過負(fù)性調(diào)節(jié)MI的活化發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳海云;董萬利;薛壽儒;惠國楨;郭禮和;;人羊膜上皮細(xì)胞側(cè)腦室移植治療腦出血大鼠實(shí)驗(yàn)研究[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2011年02期

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本文編號(hào)：1333275