本文關(guān)鍵詞：APOE和MTHFR基因多態(tài)性協(xié)同分析在阿爾茨海默病遺傳易感性的研究

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【摘要】：阿爾茨海默病(AD)是癡呆最常見的類型,是一種緩進性神經(jīng)退行疾病,表現(xiàn)為進行性認知障礙和記憶力損害,主要的病理改變有神經(jīng)炎斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)。腦組織病理檢查發(fā)現(xiàn)上述的病理特征是AD診斷的金標準,但一般難以實現(xiàn)。臨床上AD的診斷主要根據(jù)患者病史、體格檢查和神經(jīng)心理量表等,并排除其它癡呆類型。AD的發(fā)病機制還不明確,目前有不少假說解釋AD的發(fā)生發(fā)展。其中比較主流的假說有以下兩種,一種認為淀粉樣前蛋白(APP)經(jīng)β1和Y分泌酶裂解生成的Aβ由于代謝不平衡引起累積、聚集和沉積,產(chǎn)生神經(jīng)炎斑塊影響了腦組織正常的結(jié)構(gòu)和功能,最終導致AD的發(fā)生；另一種假說認為tau蛋白的過度磷酸化是AD發(fā)生的罪魁禍首。AD按照發(fā)病年齡可分為早發(fā)型和晚發(fā)型兩種,一般將發(fā)生在65歲之前的AD歸為早發(fā)型AD,發(fā)生在65歲之后歸為晚發(fā)型AD。在大于65歲人群中,AD的發(fā)生率為5-10%,65歲以后患AD的風險每隔五年翻一番,在80-90歲人群中發(fā)生率為15%-20%。晚發(fā)型AD存在遺傳易感性,最典型的遺傳危險因素是載脂蛋白E(APOE)基因多態(tài)性,除了APOE基因多態(tài)性外,其它一些危險因素也可誘發(fā)AD的發(fā)生,例如高同型半胱氨酸(HCY)血癥,高同型半胱氨酸血癥被認為是阿爾茨海默癥的另一危險因素,而5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是體內(nèi)降解HCY的重要生物酶,不可逆地催化5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸,后者作為甲基供體經(jīng)過蛋氨酸合成酶的催化,使HCY轉(zhuǎn)化成蛋氨酸。MTHFR的活性下降直接導致HCY水平的增高,因此MTHFR基因與AD的發(fā)生間接相關(guān)。APOE基因可有三種不同的等位基因,分別為ε2、ε3和ε4,這些等位基因可根據(jù)第112位和158位核苷酸的差異組合成6種基因型：ε2ε2(112TT+158TT)、ε2ε3 (112TT+158T/C)、ε2ε4 (112T/C+158T/C)、ε3ε3 (112TT+158CC)、ε3ε4(112T/C+158CC)和ε4ε4 (112CC+158CC)。ε4等位基因是AD的易感基因,￡4￡4純合子比雜合子更容易發(fā)生AD,且￡4基因攜帶者比不攜帶人群發(fā)生AD的時間更早,而￡2被認為是人群不忠AD的保護因子。MTHFR基因位于染色體1p36.3,編碼區(qū)全長1980bp,編碼蛋白的分子量為74.6kDa。cDNA序列長2.2kb,有10個內(nèi)含子和11個外顯子,長度為102-432bp,內(nèi)含子長度為250bp-1.5kb�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MTHFR基因有30余種突變類型,MTHFR基因變異導致酶活性的改變。MTHFR基因第677位核苷酸在人群中的差異最為常見,可存在三種基因型：677CC、677CT和677TT。其中677CC為野生型,677CT和677TT分別為雜合突變型和純合突變型,基因突變后所編碼的MTHFR酶活性降低且不穩(wěn)定,降低了降解HCY的功能,因此可導致HCY升高。流行病學調(diào)查表明,目前全球有3500萬人患癡呆癥,其中超過75%為AD。發(fā)病率每20年升一倍,據(jù)估計,到2050年將有1.15億人受AD影響。這不僅對患者和其家庭來說是一個極大的痛苦,對整個社會而言也構(gòu)成巨大的經(jīng)濟壓力。目前,AD尚缺乏有效的診斷指標,隨著全球老齡化速度加快,AD已經(jīng)成為社會的沉重負擔。因此干預和控制危險因素,及早對高風險人群進行干預,延緩AD的發(fā)生和發(fā)展顯得尤為重要。本研究針對AD的遺傳因子APOE基因、由其編碼的APOE、HCY以及編碼降解HCY的關(guān)鍵酶MTHFR基因作為研究目標,探討這些因素協(xié)同作用與AD的發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性。本研究分以下三個章節(jié)：第一章AD患者APOE等位基因頻率與血清APOE水平的相關(guān)性目的：檢測AD患者和健康對照組APOE基因多態(tài)性,分析兩組人群APOE等位基因頻率,同時分析所有受檢者不同APOE基因型血清APOE水平的差異、相同APOE基因型的AD患者與健康對照組的血清APOE水平的差異以及AD患者與健康對照組總體血清APOE水平的差異,探討AD患者APOE等位基因頻率與血清APOE水平的相關(guān)性。方法：根據(jù)CCMD-3診斷標準入主,收集2014年7月至2015年3月廣州市腦科醫(yī)院住院的200例AD患者作為AD組,男85例、女115例,年齡76±10歲。同時我們招募了年齡性別組成、生活環(huán)境和受教育程度等方面與AD組無顯著差異的非AD的健康老年人159例,男70例、女89例,年齡73±10歲。為了保持遺傳背景的一致性,所有受檢對象均選擇漢族人,均未服用降脂藥物。采集研究對象的清晨空腹靜脈血6～8ml,其中2~3ml以EDTA抗凝,4±1℃保存,3天內(nèi)提取DNA,用于APOE基因多態(tài)性檢測；另外4～5ml收集于真空干燥管中,當天檢測血脂。用DNA微陣列技術(shù)檢測研究對象的APOE基因多態(tài)性,并隨機抽取每種基因型各2例的PCR擴增產(chǎn)物進行DNA測序。分析APOE等位基因頻率的分布及APOE各等位基因頻率與APOE的相關(guān)性。結(jié)果：AD組APOE基因型分布：ε2ε3 (3.0%),ε2ε4(1.5%),ε3ε3(49.0%), ε3ε4 (43.5%),ε4ε4(3.0%):等位基因頻率：ε2(2.25%),ε3(72.25%),ε4(25.5%)。對照組APOE基因型分布：ε2ε2(0.6%),ε2ε3(13.8%),ε 2ε4(1.3%),ε3ε3(69.8%),ε3ε4(14.5%):等位基因頻率：ε2(8.18%),ε3(83.96%),ε4(7.86%)；AD組APOE水平為33.33±10.90mg/L,對照組為41.25±11.35mg/L。所有受檢者中,ε2、ε3、ε4攜帶者APOE分別為50.86±6.21mg/L.38.78±12.07mg/L.30.47±7.68mg/L.結(jié)論：人群中APOE等位基因所對應的APOE水平為ε2ε3ε4,有顯著差異(P≤0.05)；相同APOE基因型的AD患者與健康對照組APOE水平無顯著差異(P0.05),但AD患者APOE總體水平低于健康人群,導致這種差異的主要原因可能是AD患者中APOE ε4等位基因頻率顯著高于健康人群所致。第二章DNA微陣列技術(shù)檢測不同HCY水平人群MTHFR基因多態(tài)性目的：檢測不同水平HCY患者MTHFR基因第677核苷酸的突變頻率,探討MTHFR基因多態(tài)性與HCY水平的相關(guān)性。方法：收集廣州市腦科醫(yī)院2015年2月至2015年9月住院的HCY異�；颊�(HCY15 μmol/L)作為實驗組,共435例,男363例、女72例,平均年齡48.92±16.52歲,HCY平均水平為24.50±8.74μ mol幾。將實驗組按照HCY水平分成四組,15 μmol/LHCY≤20μmol/L為1組,20 μmol/LHCY≤25μmol/L為2組,25 μmol/LHCY≤30 μmol/L為3組,HCY30μmol/L為4組,同時收集性別、年齡和生活環(huán)境等方面與實驗組無顯著差異的HCY正常(HCY≤15μmol/L)的健康人群為對照組,共229例,男173例、女56例,平均年齡46.38±16.72歲,HCY平均水平為12.07±2.03μmol/L。采集各研究對象清晨空腹靜脈血5-6 ml,其中3～4ml置于干燥管,立即離心分離血清,1小時內(nèi)檢測HCY,另1-2ml置于EDTA抗凝管,2-8℃保存,3d內(nèi)提取DNA用于MTHFR基因檢測。用DNA微陣列技術(shù)檢測研究對象的MTHFR基因第677核苷酸的突變,統(tǒng)計分析各組MTHFR基因型及等位基因頻率分布。結(jié)果：對照組、1組、2組、3組、4組的TT基因型分布為1.7%、2.4%、8.2%、21.2%和50.8%；T等位基因頻率分別為0.207、0.212、0.306、0.403和0.670。MTHFR基因677位核苷酸由C變異為T與HCY水平顯著相關(guān)(x2=180.16,P0.0001),且隨著HCY水平升高T等位基因頻率呈增大趨勢,經(jīng)線性趨勢檢驗有統(tǒng)計意義(x2=156.67,P0.0001)；同時,單獨1組與對照組比較,MTHFR基因型和等位基因頻率分布沒有顯著差異(x 2=0.031,P0.05)。結(jié)論：MTHFR677位等位基因由C突變?yōu)門是導致HCY水平明顯升高的重要原因,而且是HCY30μmol/L人群的主要原因；而HCY輕度升高(15μmol/L HCY≤20μmol/L)可能為其它原因所致,并非MTHFR基因突變引起。第三章APOE基因和MTHFR基因協(xié)同在AD遺傳易感性中的研究目的：分析AD與APOE基因型、MTHFR基因型、APOE和HCY血清水平之間的相關(guān)性,以探討多種因素聯(lián)合在AD易感性預警中的作用。方法：用DNA微陣列技術(shù)檢測200名AD患者和159名非癡呆老年人(大于50歲)的APOE和MTHFR基因型。同時分別以免疫比濁法和酶法檢測研究對象血清APOE與HCY水平。以二分類logistic回歸方法選擇AD的預測因子,并用所獲得的預測概率建立ROC曲線。結(jié)果：APOE ε4等位基因、MTHFR TT基因型、APOE與HCY血清水平顯著影響AD的發(fā)病(P0.05)。ROC曲線下面積(AUC)為0.828 (P0.001), ROC模型AD易感性的判斷標準為大于0.413,敏感度為77.7%,特異度為76.5%。結(jié)論：APOE ε4等位基因、低APOE血清水平和高HCY血清水平是AD的獨立預測因子,MTHFR基因型是依賴APOE ε4等位基因的AD的非獨立影響因子。上述因素共同影響AD的發(fā)生,可以利用這些因素作為AD易感性的聯(lián)合預測因子。全文小結(jié)：1、本研究人群中APOE等位基因所對應的APOE水平為ε2ε3ε4,與大部分研究結(jié)果一致。2、AD患者與健康人若是相同APOE基因型,則APOE水平無統(tǒng)計學差異,若為不同APOE基因型,則APOE水平有統(tǒng)計學差異,且APOE水平為ε2ε3ε4。然而AD患者APOE血清水平卻低于健康人群。這種差異的主要原因可能是AD患者中APOE ε4等位基因頻率顯著高于健康人群所引起。3、MTHFR c677位點C→T的突變是導致HCY水平明顯升高的重要原因,而HCY輕度升高可能是其它原因所致,并非由MTHFR基因突變引起。4、 由logistics分析模型可知,APOEε4等位基因、低APOE血清水平和高HCY血清水平是AD的獨立預測因子,MTHFR基因型是依賴APOE ε4等位基因的AD的非獨立影響因子。上述因素共同影響AD的發(fā)生,可以作為AD易感性的聯(lián)合預測因子。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16

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