發(fā)布時(shí)間：2017-12-06 11:23

  本文關(guān)鍵詞：幽門螺旋桿菌在阿爾茨海默病發(fā)病中的作用和機(jī)制

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)是一種最常見的老年癡呆癥,目前全世界患病人數(shù)已超過3500萬。AD的特征性病理改變是腦內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles, NFTs)的形成,老年斑(Senile plaques, SP)大量沉積和神經(jīng)元退變死亡。到目前為止,AD的病因尚未闡明。臨床上僅有5%的患者被發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)致病基因,95%為散發(fā)性,提示AD的發(fā)生和環(huán)境因素密切相關(guān)。 幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori, H.pylori)為寄生在胃黏膜的革蘭氏陰性螺旋桿菌,全球大約有一半以上的人胃內(nèi)有H.pylori感染,其中老年人群感染率尤高。大量臨床研究表明,H.pylori慢性感染不僅直接導(dǎo)致慢性胃炎、胃潰瘍并促進(jìn)胃癌發(fā)生,也可引起或促進(jìn)消化系統(tǒng)外疾病,如格林巴利綜合癥(脊神經(jīng)和周圍神經(jīng)的脫髓鞘疾病)、高血壓、缺血性心臟病、腦缺血和中風(fēng),而這些疾患均為AD發(fā)生的危險(xiǎn)因子。最近的一些臨床流行病學(xué)調(diào)查研究為H.pylori感染與AD相關(guān)提供了更為直接的臨床證據(jù)。但是H.pylori感染到底通過何種途徑促進(jìn)AD的發(fā)生,其機(jī)制尚無報(bào)道。 本研究中重點(diǎn)探討了H.pylori感染對tau蛋白磷酸化、Aβ40、Aβ42生成以及大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制。主要結(jié)果如下： 第一部分幽門螺旋桿菌通過激活GSK-3β導(dǎo)致AD樣tau蛋白過度磷酸化 微管相關(guān)蛋白tau的過度磷酸化參與包括阿爾茨海默病在內(nèi)的許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。有報(bào)道認(rèn)為幽門螺旋桿菌感染是AD發(fā)病的危險(xiǎn)因素,但尚無直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 [目的]闡明H.pylori感染對tau蛋白磷酸化的影響及其機(jī)制。 [材料和方法]實(shí)驗(yàn)在整體和細(xì)胞水平進(jìn)行。整體水平采用雄性SD大鼠,腹腔注射H.pylori濾液,280μl/只/天,給濾液濃度研究分組如下：DMEM/Opti-MEM混合培養(yǎng)基(體積比1：1)對照組、中濃度和高濃度H.pylori濾液注射組、對應(yīng)濃度大腸桿菌(Escherichia coli. E.coli)濾液注射對照組,依據(jù)濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定給濾液時(shí)間點(diǎn)研究分組如下：DMEM/Opti-MEM混合培養(yǎng)基注射14天對照組、中濃度H.pylori濾液注射7天組、14天組和21天組,注射完畢后,麻醉取腦分離海馬,用免疫印跡檢測tau蛋白AD相關(guān)位點(diǎn)磷酸化水平,用免疫組化檢測tau蛋白在神經(jīng)元內(nèi)的定位及小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況,用酶聯(lián)免疫吸附檢測炎癥介質(zhì)IL-8和TNF-a的含量。細(xì)胞水平采用小鼠成神經(jīng)瘤(N2a)細(xì)胞系,給濾液濃度研究分組如下：DMEM/Opti-MEM混合培養(yǎng)基作為對照,低、中、高濃度H.pylori濾液孵育24小時(shí)組,對應(yīng)濃度E.coli濾液孵育24小時(shí)組。依據(jù)濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果給濾液時(shí)間點(diǎn)研究分組如下：DMEM/Opti-MEM混合培養(yǎng)基對照組,中濃度H.pylori濾液孵育6、24和36小時(shí)組。免疫印跡檢測tau磷酸化水平,tau相關(guān)蛋白激酶／磷酸酯酶活性；給予GSK-3抑制劑氯化鋰和SB216763預(yù)處理N2a細(xì)胞30分鐘,再用H.pylori濾液孵育24小時(shí),免疫印跡檢測tau磷酸化水平。 [結(jié)果]H.pylori濾液大鼠腹腔注射或孵育小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞均導(dǎo)致AD相關(guān)tau蛋白磷酸化位點(diǎn)如Thr205、Thr231和Ser404明顯過度磷酸化,并伴有糖原合酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)的激活。給予GSK-3抑制劑能有效逆轉(zhuǎn)H.pylori濾液導(dǎo)致的tau蛋白過度磷酸化。相同處理不影響使tau蛋白去磷酸化的關(guān)鍵蛋白磷酸酯酶-2A(protein phosphatase-2A, PP2A)的活性。另一種常見的腸道細(xì)菌E.coli同樣處理不影響tau磷酸化水平。 [結(jié)論]H.pylori濾液在體內(nèi)外可通過激活GSK3β導(dǎo)致AD樣tau蛋白過度磷酸化,促進(jìn)AD樣病變的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為H.pylori感染在AD樣tau病變中的作用提供了直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 第二部分幽門螺旋桿菌通過增加早老素2的表達(dá)使β-淀粉樣肽含量升高,損傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶 H.pylori感染是AD的高危因素,我們已經(jīng)在第一部分闡明H.pylori濾液腹腔注射可通過激活GSK-3β導(dǎo)致AD樣tau蛋白過度磷酸化,那么H.pylori外周感染對AD的其他病變?nèi)缯J(rèn)知功能和p淀粉樣肽生成是否有影響?其機(jī)制如何尚無報(bào)道。 [目的]闡明H.pylori對SD大鼠認(rèn)知功能和p淀粉樣肽生成的影響及其機(jī)制。 [材料和方法]實(shí)驗(yàn)在整體和細(xì)胞水平進(jìn)行。整體水平采用3月齡SD雄性大鼠,Morris水迷宮訓(xùn)練7天至15秒內(nèi)能找到隱匿平臺,形成空間記憶。然后隨機(jī)分為對照組,H.pylori組和E.coli組,分別腹腔注射體積比為1：1的DMEM/Opti-MEM混合培養(yǎng)基,H.pylori濾液和E.coli濾液,280μl/只/天連續(xù)注射7天。注射第4天時(shí)水迷宮檢測大鼠空間記憶保留情況。然后更換平臺到新的象限水迷宮重新學(xué)習(xí)3天,訓(xùn)練結(jié)束24小時(shí)后檢測大鼠對第二次學(xué)習(xí)的記憶力。第9天,水迷宮可視平臺進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力檢測后處死動(dòng)物,高爾基染色觀察海馬DG區(qū)樹突棘密度和形態(tài),尼氏染色觀察海馬和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量和密度。麻醉取腦分離海馬和皮質(zhì)組織勻漿,并提取海馬膜蛋白,用免疫印跡檢測學(xué)習(xí)記憶相關(guān)突觸受體蛋白在全海馬勻漿及海馬神經(jīng)細(xì)胞膜的表達(dá)量及海馬和皮質(zhì)p-分泌酶(BACE-1),γ-分泌酶主要成分(早老素-1,PS-1和早老素-2,PS-2)的表達(dá)量。酶聯(lián)免疫吸附分別檢測海馬和皮質(zhì)Aβ含量。細(xì)胞水平用H.pylori或E.coli濾液孵育過表達(dá)了APP的小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a-APP)24小時(shí)然后檢測Ap含量及p和γ-分泌酶表達(dá)量。 [結(jié)果]H.pylori濾液腹腔注射導(dǎo)致SD大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶損傷并伴有海馬DG區(qū)樹突棘成熟障礙,同時(shí)海馬和皮質(zhì)的Aβ42含量明顯升高且PS-2表達(dá)增加。在細(xì)胞水平用H.pylori濾液孵育N2a-APP細(xì)胞,檢測發(fā)現(xiàn)H.pylori濾液孵育后細(xì)胞內(nèi)、外Aβ42水平均升高,同時(shí)伴有PS-2上調(diào)。用E.coli做相同處理對大鼠認(rèn)知功能無影響,在細(xì)胞和整體水平也均未發(fā)現(xiàn)Ap含量明顯變化。 [結(jié)論]H.pylori外周感染后釋放某種可溶性成份可通過增加PS-2的表達(dá)量來增強(qiáng)γ分泌酶活性直接促使Aβ42生成和釋放增加,后者干擾神經(jīng)突觸功能導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能損傷,而且H.pylori濾液產(chǎn)生的上述影響是特異性的(E.coli無此影響),這為闡明H.pylori外周感染與AD發(fā)病的內(nèi)在關(guān)聯(lián)提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16

【共引文獻(xiàn)】

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