本文關鍵詞：幽門螺旋桿菌在阿爾茨海默病發(fā)病中的作用和機制

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)是一種最常見的老年癡呆癥,目前全世界患病人數(shù)已超過3500萬。AD的特征性病理改變是腦內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles, NFTs)的形成,老年斑(Senile plaques, SP)大量沉積和神經(jīng)元退變死亡。到目前為止,AD的病因尚未闡明。臨床上僅有5%的患者被發(fā)現(xiàn)存在相關致病基因,95%為散發(fā)性,提示AD的發(fā)生和環(huán)境因素密切相關。 幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori, H.pylori)為寄生在胃黏膜的革蘭氏陰性螺旋桿菌,全球大約有一半以上的人胃內(nèi)有H.pylori感染,其中老年人群感染率尤高。大量臨床研究表明,H.pylori慢性感染不僅直接導致慢性胃炎、胃潰瘍并促進胃癌發(fā)生,也可引起或促進消化系統(tǒng)外疾病,如格林巴利綜合癥(脊神經(jīng)和周圍神經(jīng)的脫髓鞘疾病)、高血壓、缺血性心臟病、腦缺血和中風,而這些疾患均為AD發(fā)生的危險因子。最近的一些臨床流行病學調(diào)查研究為H.pylori感染與AD相關提供了更為直接的臨床證據(jù)。但是H.pylori感染到底通過何種途徑促進AD的發(fā)生,其機制尚無報道。 本研究中重點探討了H.pylori感染對tau蛋白磷酸化、Aβ40、Aβ42生成以及大鼠空間學習記憶的影響及其機制。主要結(jié)果如下： 第一部分幽門螺旋桿菌通過激活GSK-3β導致AD樣tau蛋白過度磷酸化 微管相關蛋白tau的過度磷酸化參與包括阿爾茨海默病在內(nèi)的許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。有報道認為幽門螺旋桿菌感染是AD發(fā)病的危險因素,但尚無直接的實驗證據(jù)。 [目的]闡明H.pylori感染對tau蛋白磷酸化的影響及其機制。 [材料和方法]實驗在整體和細胞水平進行。整體水平采用雄性SD大鼠,腹腔注射H.pylori濾液,280μl/只/天,給濾液濃度研究分組如下：DMEM/Opti-MEM混合培養(yǎng)基(體積比1：1)對照組、中濃度和高濃度H.pylori濾液注射組、對應濃度大腸桿菌(Escherichia coli. E.coli)濾液注射對照組,依據(jù)濃度實驗結(jié)果確定給濾液時間點研究分組如下：DMEM/Opti-MEM混合培養(yǎng)基注射14天對照組、中濃度H.pylori濾液注射7天組、14天組和21天組,注射完畢后,麻醉取腦分離海馬,用免疫印跡檢測tau蛋白AD相關位點磷酸化水平,用免疫組化檢測tau蛋白在神經(jīng)元內(nèi)的定位及小膠質(zhì)細胞活化情況,用酶聯(lián)免疫吸附檢測炎癥介質(zhì)IL-8和TNF-a的含量。細胞水平采用小鼠成神經(jīng)瘤(N2a)細胞系,給濾液濃度研究分組如下：DMEM/Opti-MEM混合培養(yǎng)基作為對照,低、中、高濃度H.pylori濾液孵育24小時組,對應濃度E.coli濾液孵育24小時組。依據(jù)濃度實驗結(jié)果給濾液時間點研究分組如下：DMEM/Opti-MEM混合培養(yǎng)基對照組,中濃度H.pylori濾液孵育6、24和36小時組。免疫印跡檢測tau磷酸化水平,tau相關蛋白激酶／磷酸酯酶活性；給予GSK-3抑制劑氯化鋰和SB216763預處理N2a細胞30分鐘,再用H.pylori濾液孵育24小時,免疫印跡檢測tau磷酸化水平。 [結(jié)果]H.pylori濾液大鼠腹腔注射或孵育小鼠成神經(jīng)瘤細胞均導致AD相關tau蛋白磷酸化位點如Thr205、Thr231和Ser404明顯過度磷酸化,并伴有糖原合酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK3β)的激活。給予GSK-3抑制劑能有效逆轉(zhuǎn)H.pylori濾液導致的tau蛋白過度磷酸化。相同處理不影響使tau蛋白去磷酸化的關鍵蛋白磷酸酯酶-2A(protein phosphatase-2A, PP2A)的活性。另一種常見的腸道細菌E.coli同樣處理不影響tau磷酸化水平。 [結(jié)論]H.pylori濾液在體內(nèi)外可通過激活GSK3β導致AD樣tau蛋白過度磷酸化,促進AD樣病變的形成。本實驗結(jié)果為H.pylori感染在AD樣tau病變中的作用提供了直接實驗證據(jù)。 第二部分幽門螺旋桿菌通過增加早老素2的表達使β-淀粉樣肽含量升高,損傷大鼠空間學習記憶 H.pylori感染是AD的高危因素,我們已經(jīng)在第一部分闡明H.pylori濾液腹腔注射可通過激活GSK-3β導致AD樣tau蛋白過度磷酸化,那么H.pylori外周感染對AD的其他病變?nèi)缯J知功能和p淀粉樣肽生成是否有影響?其機制如何尚無報道。 [目的]闡明H.pylori對SD大鼠認知功能和p淀粉樣肽生成的影響及其機制。 [材料和方法]實驗在整體和細胞水平進行。整體水平采用3月齡SD雄性大鼠,Morris水迷宮訓練7天至15秒內(nèi)能找到隱匿平臺,形成空間記憶。然后隨機分為對照組,H.pylori組和E.coli組,分別腹腔注射體積比為1：1的DMEM/Opti-MEM混合培養(yǎng)基,H.pylori濾液和E.coli濾液,280μl/只/天連續(xù)注射7天。注射第4天時水迷宮檢測大鼠空間記憶保留情況。然后更換平臺到新的象限水迷宮重新學習3天,訓練結(jié)束24小時后檢測大鼠對第二次學習的記憶力。第9天,水迷宮可視平臺進行運動能力檢測后處死動物,高爾基染色觀察海馬DG區(qū)樹突棘密度和形態(tài),尼氏染色觀察海馬和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量和密度。麻醉取腦分離海馬和皮質(zhì)組織勻漿,并提取海馬膜蛋白,用免疫印跡檢測學習記憶相關突觸受體蛋白在全海馬勻漿及海馬神經(jīng)細胞膜的表達量及海馬和皮質(zhì)p-分泌酶(BACE-1),γ-分泌酶主要成分(早老素-1,PS-1和早老素-2,PS-2)的表達量。酶聯(lián)免疫吸附分別檢測海馬和皮質(zhì)Aβ含量。細胞水平用H.pylori或E.coli濾液孵育過表達了APP的小鼠成神經(jīng)瘤細胞(N2a-APP)24小時然后檢測Ap含量及p和γ-分泌酶表達量。 [結(jié)果]H.pylori濾液腹腔注射導致SD大鼠空間學習和記憶損傷并伴有海馬DG區(qū)樹突棘成熟障礙,同時海馬和皮質(zhì)的Aβ42含量明顯升高且PS-2表達增加。在細胞水平用H.pylori濾液孵育N2a-APP細胞,檢測發(fā)現(xiàn)H.pylori濾液孵育后細胞內(nèi)、外Aβ42水平均升高,同時伴有PS-2上調(diào)。用E.coli做相同處理對大鼠認知功能無影響,在細胞和整體水平也均未發(fā)現(xiàn)Ap含量明顯變化。 [結(jié)論]H.pylori外周感染后釋放某種可溶性成份可通過增加PS-2的表達量來增強γ分泌酶活性直接促使Aβ42生成和釋放增加,后者干擾神經(jīng)突觸功能導致大鼠認知功能損傷,而且H.pylori濾液產(chǎn)生的上述影響是特異性的(E.coli無此影響),這為闡明H.pylori外周感染與AD發(fā)病的內(nèi)在關聯(lián)提供了新的實驗證據(jù)。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16

【共引文獻】

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本文編號：1258432