本文關(guān)鍵詞：用于ApoE和PLD3基因分型的PCR-金磁微粒層析系統(tǒng)的建立及其臨床應(yīng)用

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【摘要】：單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)作為新一代的遺傳標(biāo)志物,被作為評估疾病易感和藥物響應(yīng)的重要因子。如載脂蛋白E (Apolipoprotein E,ApoE)具有與脂質(zhì)和受體結(jié)合的功能,不但在脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用,同時(shí)也參與神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育生長過程及其損傷后修復(fù),其基因多態(tài)性與心血管疾病以及神經(jīng)退行性疾病,如阿爾茨海默癥(Alzheimer disease, AD)的相關(guān)性備受關(guān)注。磷脂酶(A1、A2、B、C和D)可特異地作用于磷脂分子內(nèi)部的不同酯鍵,通過不同產(chǎn)物的形成調(diào)節(jié)脂類代謝。磷脂酶D3 (Phospholipase D3, PLD3)基因2014年被報(bào)道是歐洲人群新發(fā)現(xiàn)的AD易感基因,其罕見突變V232M和A442A可將個(gè)體生命后期患阿爾茨海默氏癥的風(fēng)險(xiǎn)提高2倍。隨著我國老齡化加劇和慢病檢測和管理的亟需,對大樣本人群開展疾病易感基因的篩查,不僅能獲得針對中國人群特定基因位點(diǎn)與疾病相關(guān)的數(shù)據(jù)庫,還可達(dá)到疾病預(yù)防的目的,節(jié)約大量的醫(yī)療資源。而建立快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)且適于各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)的通量SNP分型技術(shù)顯得尤為重要�；蚍中统Ｓ梅椒òy序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、基因芯片雜交、質(zhì)譜等,這些方法具有通量高,準(zhǔn)確,靈敏度高等優(yōu)勢,但對于臨床樣本分析依然存在儀器設(shè)備昂貴,檢測周期長,操作過程繁瑣,對檢測人員的專業(yè)技術(shù)要求高等不足之處。近年來,基于納米粒子的DNA檢測技術(shù)發(fā)展迅速,納米顆粒和層析技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用,可以實(shí)現(xiàn)目視化檢測目的DNA。本研究采用團(tuán)隊(duì)發(fā)明的PCR-金磁微粒層析技術(shù),建立了ApoE口PLD3的基因分型檢測方法,對臨床相關(guān)疾病的全血樣本進(jìn)行了SNP檢測,為進(jìn)一步開展易感基因的篩查奠定了基礎(chǔ)。研究目的以納米金磁微粒為載體,構(gòu)筑便捷準(zhǔn)確的等位基因特異性PCR (AS-PCR)產(chǎn)物檢測的快速層析系統(tǒng),將其用于ApoE基因分型和PLD3基因罕見突變檢測系統(tǒng)的構(gòu)建。收集相關(guān)臨床樣本,對阿爾茨海默癥以及缺血性腦卒中患者的基因型進(jìn)行篩查,并探討基因多態(tài)性與疾病易感性之間的相關(guān)性,為疾病的臨床診斷提供分子生物學(xué)指標(biāo)。方法及主要研究結(jié)果方法學(xué)的建立：以課題組自主研發(fā)的GoldMag(?)金磁微粒為載體,結(jié)合雙重AS-PCR,建立能夠快速準(zhǔn)確檢測SNP的方法,即PCR-金磁微粒層析法(PCR-GoldMag Lateral Flow Assay)。主要包括兩步,首先通過雙重AS-PCR獲取待測SNP位點(diǎn)的等位基因特異性產(chǎn)物,其通用引物的5’端修飾生物素,野生型和突變型特異引物的5’端分別修飾地高辛和異硫氰酸熒光素。在SNP位點(diǎn)的單管雙重AS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基礎(chǔ)上,進(jìn)行雙試紙條檢測。試紙條的質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)分別噴涂鏈霉親和素和羊抗鼠IgG; WT檢測試紙條和M檢測試紙條結(jié)合墊上的金磁微粒探針分別標(biāo)記有抗地高辛抗體和異硫氰酸熒光素抗體。擴(kuò)增產(chǎn)物上樣,10 mmin肉眼即可判讀結(jié)果。對層析系統(tǒng)各個(gè)參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化,并與測序法進(jìn)行了對比,結(jié)果證明該方法能夠準(zhǔn)確地判斷SNP基因型。研究結(jié)果：1.構(gòu)建ApoE基因分型的PCR-金磁微粒層析系統(tǒng)。針對ApoE*4 (rs429358TC)及ApoE*2 (rs7412 CT)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及修飾,利用雙重AS-PCR分別獲取各位點(diǎn)的等位基因特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,帶有不同修飾的PCR產(chǎn)物與層析試紙條中的金磁微粒免疫探針特異性結(jié)合,通過層析反應(yīng)實(shí)現(xiàn)ApoE基因的快速分型。對該分型系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化并引入了尿嘧啶-N-糖基化酶(JNG)-dUTP的防污染體系,性能評估結(jié)果表明：ApoE基因分型系統(tǒng)具有良好的特異性,檢測限達(dá)到10ng(基因組DNA)。利用建立的ApoE基因型檢測系統(tǒng),選用測序法作為對照,對300例臨床樣本進(jìn)行雙盲檢測。結(jié)果表明：PCR-金磁微粒層析法檢出率明顯高于測序法,具有更高的檢測靈敏度,方法的準(zhǔn)確度也達(dá)到了測序法的水平。2.采用病例對照研究,選取年齡和性別相匹配的北方漢族53例散發(fā)性阿爾茨海默病(AD)患者、130例缺血性腦卒中(IS)患者和105例健康者為研究對象。對檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析：對于AD易感性的研究中,ApoE各基因型分布在AD和對照組間差異極顯著(P0.01),E4等位基因在兩組間的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),經(jīng)風(fēng)險(xiǎn)評估,OR值為5.41；對于IS易感性的研究中,E4等位基因在IS患者中的攜帶率較對照組顯著升高(P=0.024),且E4等位基因攜帶者IS易感性明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(E4 vs E3:OR=2.19,95%CI. I.092-4.390)。臨床樣本的研究結(jié)果支持ApoE的E4等位基因?yàn)橹袊狈綕h族人群AD和IS的易感基因。3.構(gòu)建PLD3基因分型的PCR-金磁微粒層析系統(tǒng),主要用于篩選突變V232M及A442A。對100例臨床樣本進(jìn)行雙盲檢測,經(jīng)與測序結(jié)果比對,完全吻合,證明了方法學(xué)的可靠性。進(jìn)一步在53例AD患者和105例健康者進(jìn)行的應(yīng)用,初步探討V232M及A442A作為AD易感基因的潛在可能性。結(jié)果顯示,僅檢測到1例A442A突變(且存在于對照組),表明PLD3這兩個(gè)突變在中國人群中發(fā)生的概率比較低,在歐洲人群得到的PLD3罕見突變與AD易感性的關(guān)聯(lián)結(jié)果尚需在我國進(jìn)行大量臨床樣本的驗(yàn)證。本課題以納米金磁微粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)膠體金作為標(biāo)記,建立了用于兩個(gè)特定基因SNP分型的PCR-金磁微粒層析技術(shù),通過引物的設(shè)計(jì)篩選,保證了方法的特異性；金磁微粒優(yōu)于膠體金的特性,實(shí)現(xiàn)了較高的檢測靈敏度。在臨床樣本的檢測過程中,其檢測準(zhǔn)確度與測序法高度一致,此外,樣本的檢出率高于測序技術(shù)。初步的臨床應(yīng)用結(jié)果證明,該方法操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng),且結(jié)果客觀易于保存。檢測僅需規(guī)范的PCR實(shí)驗(yàn)室即可完成,無需昂貴的儀器,適合用于臨床推廣,對疾病易感基因的篩查與臨床防治和慢病管理意義重大。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R749.16;R743.3;R440

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本文編號(hào)：1228640