本文關鍵詞：用于ApoE和PLD3基因分型的PCR-金磁微粒層析系統(tǒng)的建立及其臨床應用

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【摘要】：單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)作為新一代的遺傳標志物,被作為評估疾病易感和藥物響應的重要因子。如載脂蛋白E (Apolipoprotein E,ApoE)具有與脂質(zhì)和受體結合的功能,不但在脂質(zhì)代謝中起關鍵作用,同時也參與神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育生長過程及其損傷后修復,其基因多態(tài)性與心血管疾病以及神經(jīng)退行性疾病,如阿爾茨海默癥(Alzheimer disease, AD)的相關性備受關注。磷脂酶(A1、A2、B、C和D)可特異地作用于磷脂分子內(nèi)部的不同酯鍵,通過不同產(chǎn)物的形成調(diào)節(jié)脂類代謝。磷脂酶D3 (Phospholipase D3, PLD3)基因2014年被報道是歐洲人群新發(fā)現(xiàn)的AD易感基因,其罕見突變V232M和A442A可將個體生命后期患阿爾茨海默氏癥的風險提高2倍。隨著我國老齡化加劇和慢病檢測和管理的亟需,對大樣本人群開展疾病易感基因的篩查,不僅能獲得針對中國人群特定基因位點與疾病相關的數(shù)據(jù)庫,還可達到疾病預防的目的,節(jié)約大量的醫(yī)療資源。而建立快速、準確、經(jīng)濟且適于各級醫(yī)療機構的通量SNP分型技術顯得尤為重要�；蚍中统Ｓ梅椒òy序、實時熒光定量PCR、基因芯片雜交、質(zhì)譜等,這些方法具有通量高,準確,靈敏度高等優(yōu)勢,但對于臨床樣本分析依然存在儀器設備昂貴,檢測周期長,操作過程繁瑣,對檢測人員的專業(yè)技術要求高等不足之處。近年來,基于納米粒子的DNA檢測技術發(fā)展迅速,納米顆粒和層析技術的聯(lián)合應用,可以實現(xiàn)目視化檢測目的DNA。本研究采用團隊發(fā)明的PCR-金磁微粒層析技術,建立了ApoE口PLD3的基因分型檢測方法,對臨床相關疾病的全血樣本進行了SNP檢測,為進一步開展易感基因的篩查奠定了基礎。研究目的以納米金磁微粒為載體,構筑便捷準確的等位基因特異性PCR (AS-PCR)產(chǎn)物檢測的快速層析系統(tǒng),將其用于ApoE基因分型和PLD3基因罕見突變檢測系統(tǒng)的構建。收集相關臨床樣本,對阿爾茨海默癥以及缺血性腦卒中患者的基因型進行篩查,并探討基因多態(tài)性與疾病易感性之間的相關性,為疾病的臨床診斷提供分子生物學指標。方法及主要研究結果方法學的建立：以課題組自主研發(fā)的GoldMag(?)金磁微粒為載體,結合雙重AS-PCR,建立能夠快速準確檢測SNP的方法,即PCR-金磁微粒層析法(PCR-GoldMag Lateral Flow Assay)。主要包括兩步,首先通過雙重AS-PCR獲取待測SNP位點的等位基因特異性產(chǎn)物,其通用引物的5’端修飾生物素,野生型和突變型特異引物的5’端分別修飾地高辛和異硫氰酸熒光素。在SNP位點的單管雙重AS-PCR擴增產(chǎn)物的基礎上,進行雙試紙條檢測。試紙條的質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)分別噴涂鏈霉親和素和羊抗鼠IgG; WT檢測試紙條和M檢測試紙條結合墊上的金磁微粒探針分別標記有抗地高辛抗體和異硫氰酸熒光素抗體。擴增產(chǎn)物上樣,10 mmin肉眼即可判讀結果。對層析系統(tǒng)各個參數(shù)進行了系統(tǒng)的優(yōu)化,并與測序法進行了對比,結果證明該方法能夠準確地判斷SNP基因型。研究結果：1.構建ApoE基因分型的PCR-金磁微粒層析系統(tǒng)。針對ApoE*4 (rs429358TC)及ApoE*2 (rs7412 CT)位點進行引物設計及修飾,利用雙重AS-PCR分別獲取各位點的等位基因特異性擴增產(chǎn)物,帶有不同修飾的PCR產(chǎn)物與層析試紙條中的金磁微粒免疫探針特異性結合,通過層析反應實現(xiàn)ApoE基因的快速分型。對該分型系統(tǒng)進行優(yōu)化并引入了尿嘧啶-N-糖基化酶(JNG)-dUTP的防污染體系,性能評估結果表明：ApoE基因分型系統(tǒng)具有良好的特異性,檢測限達到10ng(基因組DNA)。利用建立的ApoE基因型檢測系統(tǒng),選用測序法作為對照,對300例臨床樣本進行雙盲檢測。結果表明：PCR-金磁微粒層析法檢出率明顯高于測序法,具有更高的檢測靈敏度,方法的準確度也達到了測序法的水平。2.采用病例對照研究,選取年齡和性別相匹配的北方漢族53例散發(fā)性阿爾茨海默病(AD)患者、130例缺血性腦卒中(IS)患者和105例健康者為研究對象。對檢測結果統(tǒng)計分析：對于AD易感性的研究中,ApoE各基因型分布在AD和對照組間差異極顯著(P0.01),E4等位基因在兩組間的分布具有統(tǒng)計學意義(P0.01),經(jīng)風險評估,OR值為5.41；對于IS易感性的研究中,E4等位基因在IS患者中的攜帶率較對照組顯著升高(P=0.024),且E4等位基因攜帶者IS易感性明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義(E4 vs E3:OR=2.19,95%CI. I.092-4.390)。臨床樣本的研究結果支持ApoE的E4等位基因為中國北方漢族人群AD和IS的易感基因。3.構建PLD3基因分型的PCR-金磁微粒層析系統(tǒng),主要用于篩選突變V232M及A442A。對100例臨床樣本進行雙盲檢測,經(jīng)與測序結果比對,完全吻合,證明了方法學的可靠性。進一步在53例AD患者和105例健康者進行的應用,初步探討V232M及A442A作為AD易感基因的潛在可能性。結果顯示,僅檢測到1例A442A突變(且存在于對照組),表明PLD3這兩個突變在中國人群中發(fā)生的概率比較低,在歐洲人群得到的PLD3罕見突變與AD易感性的關聯(lián)結果尚需在我國進行大量臨床樣本的驗證。本課題以納米金磁微粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)膠體金作為標記,建立了用于兩個特定基因SNP分型的PCR-金磁微粒層析技術,通過引物的設計篩選,保證了方法的特異性；金磁微粒優(yōu)于膠體金的特性,實現(xiàn)了較高的檢測靈敏度。在臨床樣本的檢測過程中,其檢測準確度與測序法高度一致,此外,樣本的檢出率高于測序技術。初步的臨床應用結果證明,該方法操作簡便、靈敏度高、特異性強,且結果客觀易于保存。檢測僅需規(guī)范的PCR實驗室即可完成,無需昂貴的儀器,適合用于臨床推廣,對疾病易感基因的篩查與臨床防治和慢病管理意義重大。
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16;R743.3;R440

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