本文關鍵詞：可用于Aβ檢測的雙抗體夾心ELISA方法研究

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【摘要】：目的：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種與衰老相關的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其發(fā)病機制并不清楚,目前尚無有效的治療方法。淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide, Aβ)是主要的AD使動因子,而體液中Ap的檢測也成為AD早期診斷的重要指標之一。本研究旨在探討建立可用于Ap檢測的雙抗體夾心ELISA (double antibody sandwich ELISA, DAS-ELISA)的方法。方法：(1)Ap標準品的鑒定：通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)檢測體外組裝形成的可溶性Aβ40/42標準品；對樣品負染色后,采用透射電子顯微鏡技術(transmission electron microscopy, TEM)觀察其形貌；用間接ELISA檢測其免疫反應性。 (2)抗體的大量制備和性質(zhì)鑒定：復蘇并培養(yǎng)分泌候選單克隆抗體(AC-1、AC-2、AN-1和ACE-1)的雜交瘤細胞株(前期實驗已經(jīng)建立),誘生小鼠腹水并用親和層析的方法純化大量制備的單克隆抗體(以下簡稱“單抗”),同時制備必要的兔源多克隆抗血清(以下簡稱“多抗血清”)。以間接ELISA檢測抗體識別抗原的特異性、滴度以及靈敏度。(3)單抗標記：采用生物素(biotin)和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記法,并通過間接ELISA檢測標記后抗體的活性。(4)抗體配對篩選及DAS-ELISA方法的建立：優(yōu)化包被條件、包被抗體和檢測抗體的濃度等,篩選適用的抗體配對組合,測試所建立的DAS-ELISA體系的檢測靈敏度。結(jié)果：(1)SDS-PAGE結(jié)果顯示,體外組裝的可溶性Aβ40/42標準品的分子量大小在7-17 kD之間；TEM圖像顯示,其形態(tài)呈球形或串珠狀；間接ELISA結(jié)果顯示,只有Aβ42被12F4(商品化的Aβ42特異性單抗)識別。 (2)單抗AC-1特異性識別Aβ40,而AC-2特異性識別Aβ42：單抗AC-1、AC-2、AN-1和ACE-1滴度分別為1：512000、1：1024000、1：2048000以及1：256000,多抗血清BJD-002和BJD-004滴度均為1：2048000：單抗AC-1、AC-2、AN-1和ACE-1靈敏度分別為最低可檢出31.2 ng/mL、125ng/L、62.5 ng/mL以及20 ng/mL的抗原,多抗血清BJD-002和BJD-004靈敏度分別為最低可檢出31.2 ng/mL和250ng/mL的抗原。(3)獲得了4個活性標記單抗,分別是AC-1-HRP、AC-2-biotin、 AN-1-biotin和ACE-1-HRP,可用于抗體配對篩選。(4)確定最佳包被液為pH7.4的Tris-HCl緩沖液,包被抗體濃度為5 μg/mL;成功得到4組抗體配對,其中ACE-1/AC-1-HRP特異性識別Aβ40, AN-1/AC-2-biotin特異性識別Aβ42。結(jié)論：本研究成功篩選到識別不同Ap組分的抗體配對,并優(yōu)化了DAS-ELISA檢測的條件,為進一步的研究提供了實驗基礎。
【學位授予單位】：北京交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16;R446.6

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1 張韞;陳亞利;宋詩雨;王森;王e，

本文編號：1180709