發(fā)布時(shí)間：2017-11-08 19:31

  本文關(guān)鍵詞：海馬神經(jīng)元Kv7通道的活動(dòng)依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及其在急性應(yīng)激所致記憶損傷中的作用研究

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【摘要】：第一部分：海馬神經(jīng)元Kv7通道活動(dòng)依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)及機(jī)制研究 目的：研究海馬神經(jīng)元Kv7通道活動(dòng)依賴性的轉(zhuǎn)運(yùn)及其機(jī)制。方法：原代海馬神經(jīng)元(E18)體外培養(yǎng)第11-14天進(jìn)行藥物處理,水迷宮空間學(xué)習(xí)訓(xùn)練模擬海馬細(xì)胞興奮模型。Western blot方法檢測(cè)Kv7.2和Kv7.3總蛋白與細(xì)胞質(zhì)膜蛋白的變化情況,全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄M電流變化情況,細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察Kv7通道亞基蛋白在細(xì)胞上的分布變化情況。結(jié)果：(1)谷氨酸(10μM,10min)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元興奮后Kv7.2和Kv7.3總蛋白的表達(dá)沒有變化,但是細(xì)胞質(zhì)膜上的Kv7.2和Kv7.3表達(dá)水平以及M電流的幅度均降低,并且細(xì)胞質(zhì)膜上的Kv7.2和Kv7.3在谷氨酸興奮神經(jīng)元4h后恢復(fù)到正常水平；(2)NMDA(20μM,10min)和AMPA (100μM,15min)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元興奮后,細(xì)胞質(zhì)膜上的Kv7.2、Kv7.3蛋白水平和M電流的幅度均降低,NMDA受體拮抗劑D,L-APV (100μM,15min)和AMPA-KA受體拮抗劑CNQX (100μM,15min)可阻斷谷氨酸介導(dǎo)細(xì)胞膜表面Kv7通道的表達(dá)下調(diào)和M電流幅度降低；(3)胞外鈣離子螯合劑EGTA (5mM,15min)、胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM (10μM,20min)、電壓依賴性鈣離子通道阻斷劑CdCl2(200μM,15min)和L-型鈣離子通道阻斷劑(nifedipine;10μM,15min)均可抑制谷氨酸介導(dǎo)的細(xì)胞膜表面Kv7通道的表達(dá)下調(diào)和M電流幅度降低：(4)PKA激動(dòng)劑forskolin(10^iM,20min)和PKC激動(dòng)劑PMA (1μM,30min)對(duì)Kv7.2和Kv7.3總蛋白表達(dá)沒有影響,但是激活PKC可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜上Kv7.2和Kv7.3水平降低,并且PKC拮抗劑BIS I (1μM,30min)可抑谷氨酸介導(dǎo)的細(xì)胞膜表面Kv7通道的表達(dá)下調(diào)和M電流幅度降低：(5)激活突觸NMDA受體誘導(dǎo)的化學(xué)性LTP伴隨著細(xì)胞膜表面Kv7.2和Kv7.3水平降低的現(xiàn)象；(6)海馬依賴性學(xué)習(xí)訓(xùn)練模型大鼠海馬中細(xì)胞膜表面Kv7.2和Kv7.3蛋白水平明顯下調(diào)。結(jié)論：離子型谷氨酸受體介導(dǎo)海馬神經(jīng)元Kv7通道活動(dòng)依賴性轉(zhuǎn)運(yùn),鈣離子和PKC的激活參與了此轉(zhuǎn)運(yùn)過程,此信號(hào)通道可能是調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性重要的分子機(jī)制。 第二部分：Kv7通道在急性應(yīng)激所致記憶損傷中的作用研究 目的：研究Kv7通道在急性應(yīng)激所致記憶損傷中的作用。方法：SD雄性大鼠隨機(jī)分為：正常組(0.9%生理鹽水),溶劑組(0.3%DMSO),正常給藥組(5mg/kg flupirtine,8mg/kg retigabine),模型組,模型+溶劑組(0.3%DMSO),模型+激動(dòng)劑給藥組(5mg/kg flupirtine,8mg/kg retigabine),模型+激動(dòng)劑+拮抗劑給藥組(5mg/kg flupirtine+0.3mg/kg XE-991)。將大鼠放置在位于明亮空間中央的一個(gè)不穩(wěn)定高臺(tái)上持續(xù)30min制作高臺(tái)恐懼急性應(yīng)激模型。Western blotting方法檢測(cè)蛋白表達(dá),水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物的空間記憶能力,在體場(chǎng)電位方法記錄海馬CA1區(qū)興奮性突觸后電位(fEPSP)。結(jié)果：(1)急性應(yīng)激大鼠海馬中Kv7.2和Kv7.3表達(dá)水平明顯下調(diào);(2)急性應(yīng)激損傷大鼠的空間記憶和海馬LTP；(3)Kv7通道激動(dòng)劑-氟吡汀(flupirtine,5mg/kg)或瑞替加濱(8mg/kg)能夠有效減輕急性應(yīng)激所致的空間記憶障礙和海馬LTP受損,并且flupirtine的保護(hù)作用能夠被Kv7通道特異性阻斷劑XE-991(0.3mg/kg)阻斷;(4)急性應(yīng)激大鼠海馬中p-Ser9-GSK-3β表達(dá)明顯降低；(5) flupirtine (5mg/kg)或retigabine (8mg/kg)能夠逆轉(zhuǎn)急性應(yīng)激所致的p-Ser9-GSK-3β表達(dá)降低,XE-991(0.3mg/kg)能夠拮抗flupirtine (5mg/kg)的作用；(6)急性應(yīng)激大鼠海馬中β-catenin水平明顯下調(diào),flupirtine (5mg/kg)或retigabine (8mg/kg)能夠抑制急性應(yīng)激所致的β-catenin水平下降,XE-991(0.3mg/kg)能夠拮抗flupirtine (5mg/kg)的作用；結(jié)論：急性應(yīng)激損傷導(dǎo)致海馬神經(jīng)元Kv7通道蛋白表達(dá)降低,Kv7通道激活劑flupirtine和retigabine能夠改善急性應(yīng)激所致的空間記憶障礙和海馬LTP受損,此作用可能與調(diào)控GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路有關(guān),Kv7通道可能是保護(hù)急性應(yīng)激所致海馬功能損傷的潛在作用靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R749

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本文編號(hào)：1158549