本文關(guān)鍵詞：pri-miR-146a單核苷酸多肽性降低miR-146a表達(dá)及與阿爾茨海默病發(fā)病相關(guān)研究

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【摘要】：背景與目的阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是發(fā)生于老年和老年前期的一種漸進(jìn)性的神經(jīng)退行性疾病,并且是老年人口中最常見的癡呆性疾病,它在臨床上主要表現(xiàn)特征為慢性進(jìn)行性記憶力減退、失語、失用、失認(rèn)、視空間能力損害、抽象思維和計(jì)算力損害以及人格行為改變等。目前普遍認(rèn)為阿爾茨海默病是由于神經(jīng)元變性引起的,而后者又是由于神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)炎性斑所導(dǎo)致。據(jù)統(tǒng)計(jì),65歲以上老年人約有5%患有AD,2006年,阿爾茨海默病在世界范圍內(nèi)達(dá)到2660萬,到2050年,全球預(yù)計(jì)達(dá)到85個(gè)人中就有一個(gè)阿爾茨海默病患者的比例。目前,對(duì)于阿爾茨海默病的治療只能對(duì)癥,仍然沒有可行的治療來預(yù)防或延緩疾病的進(jìn)程的方案。同時(shí),對(duì)于阿爾茨海默病的發(fā)病原因目前也尚不清楚。至今為止,關(guān)于阿爾茨海默病發(fā)病原因有多種假設(shè),其中最經(jīng)典的假設(shè)為阿爾茨海默病是由一個(gè)Aβ42異常的淀粉樣蛋白的沉積造成的,而淀粉樣前體蛋白(amyloid precusor protein, APP)異常也會(huì)加快該疾病的進(jìn)展。阿爾茨海默病神經(jīng)方面的病理變化是由神經(jīng)元和突觸的損傷所造成的,細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維呈纏結(jié)排列,細(xì)胞外出現(xiàn)淀粉樣斑塊。最近,越來越多的研究表明,神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)失調(diào)也是AD發(fā)病的機(jī)制之一。身體的免疫系統(tǒng)炎癥與阿爾茨海默病密切相關(guān),而先天性免疫系統(tǒng)對(duì)腦代謝、神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)等方面是至關(guān)重要的。一旦免疫系統(tǒng)和炎癥信號(hào)途徑被激活,機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生過量的氧自由基,其次促炎性細(xì)胞因子以及前列腺素也會(huì)大量表達(dá),進(jìn)而引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病和阿爾茨海默病的發(fā)生和進(jìn)展。基于以上原因,關(guān)于阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)理目前仍然需要更深入的研究。microRNAs(微小RNA,miRNAs)是一種長度為21-25個(gè)核苷酸、成熟的內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子并具有高度保守的RNAs,它主要在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用,通過靶向3’端未翻譯區(qū)域,干擾靶mRNA切割或抑制翻譯來調(diào)控基因的表達(dá)。已經(jīng)有研究證實(shí),miRNA參與了不同的生物學(xué)進(jìn)程,在多種人類疾病中發(fā)揮作用并參與幾乎所有的生物學(xué)進(jìn)程,包括疾病的發(fā)展、細(xì)胞分化、增殖與死亡。研究發(fā)現(xiàn),miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后都有密切聯(lián)系。目前,有學(xué)者認(rèn)為出現(xiàn)在miRNA或其結(jié)合部位的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是導(dǎo)致miRNA遺傳變異的的異常源頭,從而導(dǎo)致癌癥等疾病易感性的差別。研究者認(rèn)為,基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基,其中最少一種在群體中的頻率不小于1%,這種基因組的單個(gè)位點(diǎn)上的堿基的差異稱為SNPs,它是存在于人群中每個(gè)個(gè)體的基因序列細(xì)微差別,在整個(gè)人類基因組中分布相當(dāng)廣泛,其具有的生物學(xué)功能,可以通過影響成熟miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、表達(dá)水平及其與靶基因的識(shí)別,使miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生異常,進(jìn)而與癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究提示miRNA可能在阿爾茨海默病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。目前,研究報(bào)道在阿爾茨海默病患者的血液中發(fā)現(xiàn)多種miRNA的異常表達(dá),其中包括miR-137, miR-181c, miR-9, miR-16和miR-29a/b等。進(jìn)一步的研究表明,miR-146參與到炎癥信號(hào)的上調(diào)過程中,而炎癥信號(hào)的上調(diào)與朊病毒誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性變、類風(fēng)濕及顳葉癲癇病有很大的相關(guān)性。另外,在阿爾茨海默病患者的腦組織中,發(fā)現(xiàn)miR-146的異常表達(dá),這就提示異常的miR-146表達(dá)可能是導(dǎo)致阿爾茨海默病患者炎性老年斑病變形成的重要因素。同時(shí)研究者也發(fā)現(xiàn),在阿爾茨海默病病人腦組織及五個(gè)不同的阿爾茨海默病動(dòng)物模型中,miR-146a呈現(xiàn)異常表達(dá)的現(xiàn)象,其次在阿爾茨海默病的解剖神經(jīng)病理組織中,也同樣發(fā)現(xiàn)了miRNA-146a的異常表達(dá),這些均提示miR-146a可能在阿爾茨海默病中發(fā)揮重要的作用。但是由于上述研究存在樣本量少的現(xiàn)象,因此亟需大量的廣泛的研究以明確miRNA-146a與阿爾茨海默病的相關(guān)性。在本研究中,我們對(duì)103例阿爾茨海默病患者進(jìn)行pri-miR-146a基因組DNA的序列分析,雖然沒有發(fā)現(xiàn)明顯的基因組系列的變化,但是我們發(fā)現(xiàn),在阿爾茨海默病患者中存在pri-miR-146a的核苷酸多態(tài)性。進(jìn)一步通過qRT-PCR分析,我們發(fā)現(xiàn)C等位基因能夠明顯降低成熟的miR-146a的表達(dá)。重要的是,miR-146a表達(dá)的降低又進(jìn)一步導(dǎo)致抑制性靶基因TLR2的高表達(dá),而TLR2能夠促進(jìn)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng),從而進(jìn)一步導(dǎo)致阿爾茨海默病的發(fā)生。研究方法1.血液標(biāo)本的收集本病例組選取作者所在醫(yī)院的103例AD病例為研究對(duì)象,同時(shí)以206例健康志愿者為正常的研究對(duì)照。所有患者均為無血緣關(guān)系的獨(dú)立的漢族人群。正常對(duì)照組從醫(yī)院的健康檢查中心隨機(jī)選取,無明顯的臨床癥狀。按年齡匹配相應(yīng)的對(duì)照,抽取兩者外周血。研究對(duì)象必須簽署知情同意書,并提供相關(guān)的完整的流行病學(xué)調(diào)查。2.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)HEK293T及RAW264.7細(xì)胞在含有10%肽牛血清、100IU/ml的青霉素及10 mg/mL鏈霉素的DMED培養(yǎng)基中按照常規(guī)培養(yǎng)方案,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。3.RNA的提取與miR-146a的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用TRIzol分別提取樣本中的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,運(yùn)用Quantitive RT-PCR測(cè)出樣本中成熟的miR-146a與miR-146a前體的含量。4.載體構(gòu)建PCR獲得各突變體的片斷,膠回收各突變體的片斷,酶切回收片段與載體,將片段與載體進(jìn)行連接反應(yīng)后,轉(zhuǎn)化挑克隆,進(jìn)行PCR及酶切鑒定。5. miR-146a的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)選miR-146a表達(dá)水平低的HEK293T細(xì)胞作轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),HEK293T接種于12孔板中,用miR-146a mimic及miR-146a mimicNC對(duì)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,然后分析轉(zhuǎn)染后miR-146a對(duì)HEK293T細(xì)胞產(chǎn)生的相對(duì)應(yīng)的影響。6.雙熒光酶活性分析HEK293T接種于48孔板中,采用lipo 2000將熒光素酶報(bào)告基因與miR-146a模擬物及抑制物共同進(jìn)行轉(zhuǎn)染,2天之后對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行收取,采用雙熒光素報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)基因的表達(dá)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)三次。結(jié)果表示為相對(duì)熒光素酶活性。7. Western blotting通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)蛋白進(jìn)行分離,然后將瓊脂糖凝膠的蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上,膜經(jīng)過單克隆抗體孵育后,特異性蛋白復(fù)合物再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)后,暗室曝光顯影,即為所分析蛋白的表達(dá)水平。8. ELISA采用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-a的分泌水平。9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行,進(jìn)行研究數(shù)據(jù)的精確分析,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采取t檢驗(yàn)比較兩組間的差異,多組間比較采用單因素方差分析,P0.05表示差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.在阿爾茨海默病患者的外周血中rs2910164中異常C等位基因明顯增加。為了分析pre-miR-146核苷酸多肽性與阿爾茨海默病的相關(guān)性,采用Taqman等位基因鑒別儀,對(duì)103例阿爾茨海默病患者與206例配對(duì)正常人血液樣本中pre-miR-146a編碼區(qū)核苷酸多肽性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)103例阿爾茨海默病患者血液樣本與配對(duì)的206例正常人血液樣本比較,稀有等位基因C的表達(dá)在阿爾茨海默病患者血液樣本中明顯增加。2.異常C等位基因降低體內(nèi)外miR-146a的表達(dá)。將不同基因型的pre-miR-146a表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,分析成熟的miR-146a的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與rs2910164 G及GC雜合子基因型相比,C基因型降低成熟的]miR-146a表達(dá)量達(dá)到32%。進(jìn)一步體內(nèi)對(duì)阿爾茨海默病患者血清樣本中pri-miR-146a不同基因型對(duì)于miR-146a表達(dá)的分析發(fā)現(xiàn),與rs2910164 GG基因型攜帶阿爾茨海默病患者相比,CC基因型攜帶患者mir-146a表達(dá)水平明顯降低。3. miR-146a表達(dá)的降低導(dǎo)致其抑制性靶基因TLR2的表達(dá)上調(diào)。為了驗(yàn)證TLR2是否是miR-146a的靶基因,將828bp的3’-UTR克隆至含有熒光素酶報(bào)告基因的pGL3載體中,形成雙熒光系統(tǒng)的pGL3-TLR2質(zhì)粒,將雙熒光系統(tǒng)的pGL3-TLR2質(zhì)粒與niR-146a、miR-146a模擬物及抑制物共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與miR-146a模擬物及抑制物共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中相比,轉(zhuǎn)染miR-146a組熒光強(qiáng)度明顯降低,即miR-146a能夠抑制TLR2的表達(dá),同時(shí)也明顯抑制TLR2蛋白的表達(dá)。4.RAW264.7細(xì)胞在Aβ42的刺激上,pri-miR-146a C基因型能夠上調(diào)TNF-α的分泌。在細(xì)胞系水平分析異常等位基因C的功能,通過轉(zhuǎn)染pri-miR-146a不同基因型載體至RAW264.7細(xì)胞,研究發(fā)現(xiàn),在Aβ42的刺激上,轉(zhuǎn)染pri-miR-146a-C基因型的細(xì)胞比pri-miR-146a-G基因型的細(xì)胞上清TNF-α的分泌水平增加71.1%。研究結(jié)論1.阿爾茨海默病患者存在pre-miR-146a的單核苷酸多肽性；2. miR-146a多態(tài)位點(diǎn)rs2910164 C等位基因可能導(dǎo)致阿爾茨海默病的易感性；3. miR-146a在阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R749.16

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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3 胡勇博;任汝靜;;微小RNA在阿爾茨海默病診斷中的作用及其應(yīng)用前景[J];內(nèi)科理論與實(shí)踐;2015年02期

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本文編號(hào)：1158275