發(fā)布時(shí)間：2017-11-07 02:13

  本文關(guān)鍵詞：血管性認(rèn)知功能障礙小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞極化與白質(zhì)損傷的研究

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【摘要】：血管性認(rèn)知障礙(vascular cognitive impairment,VCI)是指腦血管損傷所致的認(rèn)知功能障礙,2011年美國(guó)心臟學(xué)會(huì)(American heart association,AHA)聯(lián)合美國(guó)卒中學(xué)會(huì)(American stroke association,ASA)發(fā)布的VCI診斷標(biāo)準(zhǔn)包括三個(gè)要點(diǎn):即認(rèn)知功能障礙的存在、腦血管疾病的證據(jù)及腦血管疾病與認(rèn)知障礙存在相關(guān)性,另外規(guī)定VCI是血管源性所致從輕度認(rèn)知功能損害到癡呆的認(rèn)知功能缺損全過程,因此我們可以認(rèn)為VCI具有持續(xù)性、進(jìn)展性的特點(diǎn)。VCI一旦發(fā)生,根據(jù)現(xiàn)在的醫(yī)療水平,我們無法阻斷疾病的發(fā)展進(jìn)程,VCI加重的后果則是給社會(huì)及家庭戴上了沉重的經(jīng)濟(jì)和精神枷鎖。然而我們對(duì)腦血管疾病致認(rèn)知功能障礙發(fā)生的機(jī)制并未完全了解。在臨床研究中,過去的30年里大量研究表明磁共振T2序列上的腦白質(zhì)高信號(hào)(white matter hyperintense,WMH)與認(rèn)知功能障礙存在重要聯(lián)系,常提示腦白質(zhì)損傷(white matter lesions,WMLs)。Shibata等人的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)慢性腦灌注不足成功的導(dǎo)致了腦白質(zhì)的受損,并觀察到在第30天時(shí),動(dòng)物的工作記憶受損與腦白質(zhì)的損傷是同時(shí)出現(xiàn)的。因此,腦缺血所致的白質(zhì)損傷,即髓鞘或少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷是VCI發(fā)生的重要原因。那么,有哪些因素對(duì)髓鞘損傷和修復(fù)產(chǎn)生了重要的影響呢?小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦組織主要的炎癥參與細(xì)胞,釋放的大量炎癥因子與腦白質(zhì)受損不無關(guān)聯(lián),但除了炎癥,小膠質(zhì)細(xì)胞活化可能還存在其他的下游機(jī)制導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞一方面與VCI的髓鞘損傷密切相關(guān),一方面對(duì)髓鞘的生成又是必須的,這是一個(gè)看似矛盾的地方。結(jié)合近年來發(fā)現(xiàn)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化的兩種形態(tài):產(chǎn)生促炎因子的M1型、產(chǎn)生抗炎因子的M2型,即小膠質(zhì)細(xì)胞的“極化”,我們推測(cè),缺血引起的大腦內(nèi)環(huán)境紊亂激活了小膠質(zhì)細(xì)胞,并通過某條通路使得小膠質(zhì)細(xì)胞更多向M1型活化,進(jìn)一步引起了炎癥因子的釋放,最終導(dǎo)致了VCI的發(fā)生。那么,是什么機(jī)制調(diào)控了小膠質(zhì)細(xì)胞的極化方向呢?有研究表明Fractalkine/CX3CR1通路可能在這一過程中發(fā)揮重要作用,而本課題希望就此進(jìn)行相關(guān)研究。因此,我們提出假說,Fractalkine/CX3CR1通路調(diào)控的小膠質(zhì)細(xì)胞極化在VCI的發(fā)生過程中起到了重要作用。本研究擬通過雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血法制備不同缺血時(shí)間的血管性認(rèn)知功能障礙小鼠模型,應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠認(rèn)知行為變化進(jìn)行觀察并挑選行為與病理表現(xiàn)更為穩(wěn)定的模型,采用免疫組化、蛋白免疫印跡、免疫熒光雙標(biāo)等技術(shù)對(duì)髓鞘脫失程度、小膠質(zhì)活化情況、小膠質(zhì)細(xì)胞極化情況等進(jìn)行檢測(cè),探討小膠質(zhì)細(xì)胞的極化參與VCI發(fā)生的機(jī)制,為VCI的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。方法第一部分:血管性認(rèn)知障礙小鼠模型的建立與髓鞘損傷的研究成年雄性健康icr小鼠,隨機(jī)分為模型組(vci)和假手術(shù)組(sham),vci組24只,sham組8只;vci組再隨機(jī)分為缺血10分鐘組(vci-10min),缺血30分鐘組(vci-30min),缺血60分鐘組(vci-60min)。模型組0.3%戊巴比妥麻醉后采用雙側(cè)頸動(dòng)脈夾閉法制備血管性認(rèn)知功能障礙小鼠模型,缺血時(shí)間各組不同。假手術(shù)組除不阻斷供血外其余手術(shù)操作同模型組。術(shù)后第7天至第10天行morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)知功能。認(rèn)知功能測(cè)試結(jié)束后處死灌殺取腦,制備石蠟切片后行勞克堅(jiān)勞藍(lán)(luxolfastblue,lfb)染色、髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein,mbp)及谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(glutathiones-transferase,gst-pi)免疫組化染色,觀察術(shù)后第10天海馬區(qū)髓鞘脫失程度、少突膠質(zhì)細(xì)胞以及胼胝體白質(zhì)損傷情況。第二部分:血管性認(rèn)知障礙小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的研究成年雄性健康icr小鼠,隨機(jī)分為模型組(vci)和假手術(shù)組(sham);采用隨機(jī)數(shù)法隨機(jī)將vci組小鼠分為術(shù)后1天(vci-24h)、術(shù)后7天(vci-7d)和術(shù)后15天(vci-15d)三個(gè)亞組,每個(gè)亞組16只。假手術(shù)組48只,分別于術(shù)后1、7、15天隨機(jī)提取16只。模型組0.3%戊巴比妥麻醉后采用雙側(cè)頸動(dòng)脈夾閉法制備血管性認(rèn)知功能障礙小鼠模型,雙側(cè)頸動(dòng)脈缺血時(shí)間為60分鐘;假手術(shù)組除不阻斷雙側(cè)頸動(dòng)脈血流,其余步驟同模型組。術(shù)后24小時(shí)、術(shù)后第7天、術(shù)后第15天,分別對(duì)各亞組模型小鼠與假手術(shù)組小鼠進(jìn)行灌注取腦,分別制備石蠟切片及海馬組織蛋白勻漿。取石蠟切片進(jìn)行cd11b/inos(induciblenitricoxidesynthase,誘導(dǎo)型氮氧化物合酶)及arg-1(arginase-1,精氨酸酶-1)免疫熒光染色,及海馬勻漿蛋白免疫印跡觀察vci模型的小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況,進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞向m1型或m2型極化方向的研究,以及fractalkine/cx3cr1信號(hào)通路的研究。結(jié)果第一部分:血管性認(rèn)知障礙小鼠模型的建立與髓鞘損傷的研究vci小鼠術(shù)后術(shù)后第9天(postoperationday,pod)找到平臺(tái)潛伏期時(shí)間(latency)延長(zhǎng)(假手術(shù)組18.07±5.86s,缺血60min組41.90±4.52s,t=㧟9.11,p=0.000)。四組小鼠pod9時(shí)找到站臺(tái)潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(假手術(shù)組18.07±5.86s,缺血10min組26.64±9.37s,缺血30min組33.44±6.65s,缺血60min組41.90±4.52s,f=17.52,p=0.000),四組小鼠空間探索試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)象限活動(dòng)時(shí)間存在差異(假手術(shù)組26.15±6.02s,缺血10min組22.08±3.49s,缺血30min組20.67±3.53s,缺血60min組12.22±2.26,f=16.63,p=0.000),與假手術(shù)組相比,缺血10min組目標(biāo)象限活動(dòng)時(shí)間下降不明顯(p0.05),缺血30分鐘組、缺血60分鐘組減少(p0.05)。mbp免疫組化染色結(jié)果:四組小鼠mbp染色積分光密度值(integratedopticaldensity,iod)與假手術(shù)組平均iod比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(假手術(shù)組1.00±0.07,缺血10min組0.71±0.08,缺血30min組0.53±0.08,缺血60min組0.29±0.13,f=82.28,p=0.000),與假手術(shù)組相比,缺血10min組、缺血30min組、缺血60min組mbp染色iod與假手術(shù)組平均iod比值減少(p0.05)。lfb染色結(jié)果提示:四組小鼠lfb染色iod與假手術(shù)組平均iod比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(假手術(shù)組1.00±0.32,缺血10min組0.82±0.16,缺血30min組0.62±0.12,缺血60min組0.40±0.19,f=12.16,p=0.000),與假手術(shù)組相比,缺血10min組減少不顯著(p0.05),缺血30min組、缺血60min組減少(p0.05)。gst-pi免疫組化染色結(jié)果:四組小鼠gst-pi陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(假手術(shù)組23.02±4.83/mm~2,缺血10min組21.01±2.14/mm~2,缺血30min組18.08±2.01/mm~2,缺血60min組15.03±1.66/mm~2,f=11.22,p=0.000),與假手術(shù)組相比,缺血10min組gst-pi陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無明顯差異(p0.05),缺血30min組、缺血60min組gst-pi陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均減少(p0.05)。第二部分:血管性認(rèn)知障礙小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的研究與假手術(shù)組小鼠相比,vci組小鼠海馬勻漿的cd11biod與內(nèi)參iod比值明顯增加(假手術(shù)組0.21±0.11,vci-15d組0.61±0.17,t=㧟5.66,p=0.000)。四組小鼠海馬勻漿inos條帶iod與內(nèi)參iod比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(假手術(shù)組1.04±0.13,vci-24h組0.99±0.09,vci-7d組1.13±0.08,vci-15d組1.17±0.17,f=3.37,p=0.032),與假手術(shù)組相比,vci-24h組inos條帶iod與內(nèi)參iod比值減少不顯著(p0.05)vci-7d組、vci-15d組inos條帶iod與內(nèi)參iod比值有所增加,但不顯著(p0.05),但vci-15d組inos條帶iod與內(nèi)參iod比值較vci-24h組增加且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。四組小鼠海馬勻漿arg-1條帶iod與內(nèi)參iod比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(假手術(shù)組0.82±0.08,vci-24h組0.96±0.14,vci-7d組0.94±0.11,vci-15d組0.64±0.26,f=6.35,p=0.002),與假手術(shù)組相比,vci-24h組、vci-7d組arg-1條帶iod與內(nèi)參iod比值增加不顯著(p0.05),vci-15d組arg-1條帶iod與內(nèi)參iod比值明顯降低(p0.05)。免疫熒光染色結(jié)果:與假手術(shù)組相比,VCI-15d組CD11b/i NOS雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(假手術(shù)組15.66±0.78/mm~2,VCI-15d組22.11±2.27/mm~2,t=㧟7.62,P=0.000)。與假手術(shù)組相比,VCI-15d組Arg-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(假手術(shù)組19.18±2.45/mm~2,VCI-15d組12.18±2.16/mm~2,t=6.06,P=0.000)。Fractalkine/CX3CR1信號(hào)通路蛋白免疫印跡結(jié)果:與假手術(shù)組相比,VCI-15d組小鼠海馬勻漿中CX3CL1條帶IOD與內(nèi)參IOD比值上升(假手術(shù)組0.23±0.12,VCI-15d組0.47±0.22,t=㧟2.83,P=0.013),VCI-15d組小鼠海馬勻漿中CX3CR1條帶IOD與內(nèi)參IOD比值上升(假手術(shù)組0.32±0.11,VCI-15d組0.45±0.10,t=㧟2.60,P=0.021),VCI-15d組核轉(zhuǎn)錄因子κB-p50(Nuclear Factor-Kappa B,NF-κB)條帶IOD與內(nèi)參IOD比值明顯增加(假手術(shù)組0.46±0.14,VCI-15d組0.78±0.12,t=㧟5.01,P=0.000),VCI-15d組環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP Response Element-Binding Protein,CREB)條帶IOD與內(nèi)參IOD比值增加不顯著(假手術(shù)組0.11±0.05,VCI-15d組0.13±0.09,t=㧟0.60,P=0.56)。結(jié)論通過調(diào)控雙側(cè)頸動(dòng)脈不同缺血時(shí)間建立并比較不同缺血時(shí)間的血管性認(rèn)知障礙小鼠模型,證明短暫性腦缺血即可出現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘損傷,以及認(rèn)知功能障礙。然而缺血60分鐘所致?lián)p傷更為明顯、穩(wěn)定,是研究小膠質(zhì)細(xì)胞極化的合適模型。通過對(duì)VCI模型的小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況的觀察,小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型與M2型極化方向的研究,以及對(duì)Fractalkine/CX3CR1信號(hào)通路的研究,表明在腦缺血情況下,VCI動(dòng)物腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活,主要為M1型,Fractalkine/CX3CR1信號(hào)通路激活,主要向NF-κB方向?qū)е翸1型激活,從而引起促炎反應(yīng)導(dǎo)致髓鞘損傷。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.13

【參考文獻(xiàn)】

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1 李海龍;鄭惠文;劉敏;黎佳思;王云霞;趙善民;畢曉瑩;;血管性認(rèn)知障礙小鼠腦內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞再生分化障礙特點(diǎn)研究[J];中國(guó)卒中雜志;2015年11期

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本文編號(hào)：1150388