本文關(guān)鍵詞：血管性認知功能障礙小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞極化與白質(zhì)損傷的研究

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【摘要】：血管性認知障礙(vascular cognitive impairment,VCI)是指腦血管損傷所致的認知功能障礙,2011年美國心臟學(xué)會(American heart association,AHA)聯(lián)合美國卒中學(xué)會(American stroke association,ASA)發(fā)布的VCI診斷標(biāo)準包括三個要點:即認知功能障礙的存在、腦血管疾病的證據(jù)及腦血管疾病與認知障礙存在相關(guān)性,另外規(guī)定VCI是血管源性所致從輕度認知功能損害到癡呆的認知功能缺損全過程,因此我們可以認為VCI具有持續(xù)性、進展性的特點。VCI一旦發(fā)生,根據(jù)現(xiàn)在的醫(yī)療水平,我們無法阻斷疾病的發(fā)展進程,VCI加重的后果則是給社會及家庭戴上了沉重的經(jīng)濟和精神枷鎖。然而我們對腦血管疾病致認知功能障礙發(fā)生的機制并未完全了解。在臨床研究中,過去的30年里大量研究表明磁共振T2序列上的腦白質(zhì)高信號(white matter hyperintense,WMH)與認知功能障礙存在重要聯(lián)系,常提示腦白質(zhì)損傷(white matter lesions,WMLs)。Shibata等人的動物研究發(fā)現(xiàn)慢性腦灌注不足成功的導(dǎo)致了腦白質(zhì)的受損,并觀察到在第30天時,動物的工作記憶受損與腦白質(zhì)的損傷是同時出現(xiàn)的。因此,腦缺血所致的白質(zhì)損傷,即髓鞘或少突膠質(zhì)細胞損傷是VCI發(fā)生的重要原因。那么,有哪些因素對髓鞘損傷和修復(fù)產(chǎn)生了重要的影響呢?小膠質(zhì)細胞作為腦組織主要的炎癥參與細胞,釋放的大量炎癥因子與腦白質(zhì)受損不無關(guān)聯(lián),但除了炎癥,小膠質(zhì)細胞活化可能還存在其他的下游機制導(dǎo)致認知功能障礙的發(fā)生。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細胞一方面與VCI的髓鞘損傷密切相關(guān),一方面對髓鞘的生成又是必須的,這是一個看似矛盾的地方。結(jié)合近年來發(fā)現(xiàn)的小膠質(zhì)細胞活化的兩種形態(tài):產(chǎn)生促炎因子的M1型、產(chǎn)生抗炎因子的M2型,即小膠質(zhì)細胞的“極化”,我們推測,缺血引起的大腦內(nèi)環(huán)境紊亂激活了小膠質(zhì)細胞,并通過某條通路使得小膠質(zhì)細胞更多向M1型活化,進一步引起了炎癥因子的釋放,最終導(dǎo)致了VCI的發(fā)生。那么,是什么機制調(diào)控了小膠質(zhì)細胞的極化方向呢?有研究表明Fractalkine/CX3CR1通路可能在這一過程中發(fā)揮重要作用,而本課題希望就此進行相關(guān)研究。因此,我們提出假說,Fractalkine/CX3CR1通路調(diào)控的小膠質(zhì)細胞極化在VCI的發(fā)生過程中起到了重要作用。本研究擬通過雙側(cè)頸動脈缺血法制備不同缺血時間的血管性認知功能障礙小鼠模型,應(yīng)用Morris水迷宮實驗對小鼠認知行為變化進行觀察并挑選行為與病理表現(xiàn)更為穩(wěn)定的模型,采用免疫組化、蛋白免疫印跡、免疫熒光雙標(biāo)等技術(shù)對髓鞘脫失程度、小膠質(zhì)活化情況、小膠質(zhì)細胞極化情況等進行檢測,探討小膠質(zhì)細胞的極化參與VCI發(fā)生的機制,為VCI的治療提供新的思路和靶點。方法第一部分:血管性認知障礙小鼠模型的建立與髓鞘損傷的研究成年雄性健康icr小鼠,隨機分為模型組(vci)和假手術(shù)組(sham),vci組24只,sham組8只;vci組再隨機分為缺血10分鐘組(vci-10min),缺血30分鐘組(vci-30min),缺血60分鐘組(vci-60min)。模型組0.3%戊巴比妥麻醉后采用雙側(cè)頸動脈夾閉法制備血管性認知功能障礙小鼠模型,缺血時間各組不同。假手術(shù)組除不阻斷供血外其余手術(shù)操作同模型組。術(shù)后第7天至第10天行morris水迷宮實驗檢測認知功能。認知功能測試結(jié)束后處死灌殺取腦,制備石蠟切片后行勞克堅勞藍(luxolfastblue,lfb)染色、髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein,mbp)及谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(glutathiones-transferase,gst-pi)免疫組化染色,觀察術(shù)后第10天海馬區(qū)髓鞘脫失程度、少突膠質(zhì)細胞以及胼胝體白質(zhì)損傷情況。第二部分:血管性認知障礙小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞極化的研究成年雄性健康icr小鼠,隨機分為模型組(vci)和假手術(shù)組(sham);采用隨機數(shù)法隨機將vci組小鼠分為術(shù)后1天(vci-24h)、術(shù)后7天(vci-7d)和術(shù)后15天(vci-15d)三個亞組,每個亞組16只。假手術(shù)組48只,分別于術(shù)后1、7、15天隨機提取16只。模型組0.3%戊巴比妥麻醉后采用雙側(cè)頸動脈夾閉法制備血管性認知功能障礙小鼠模型,雙側(cè)頸動脈缺血時間為60分鐘;假手術(shù)組除不阻斷雙側(cè)頸動脈血流,其余步驟同模型組。術(shù)后24小時、術(shù)后第7天、術(shù)后第15天,分別對各亞組模型小鼠與假手術(shù)組小鼠進行灌注取腦,分別制備石蠟切片及海馬組織蛋白勻漿。取石蠟切片進行cd11b/inos(induciblenitricoxidesynthase,誘導(dǎo)型氮氧化物合酶)及arg-1(arginase-1,精氨酸酶-1)免疫熒光染色,及海馬勻漿蛋白免疫印跡觀察vci模型的小膠質(zhì)細胞激活情況,進行小膠質(zhì)細胞向m1型或m2型極化方向的研究,以及fractalkine/cx3cr1信號通路的研究。結(jié)果第一部分:血管性認知障礙小鼠模型的建立與髓鞘損傷的研究vci小鼠術(shù)后術(shù)后第9天(postoperationday,pod)找到平臺潛伏期時間(latency)延長(假手術(shù)組18.07±5.86s,缺血60min組41.90±4.52s,t=㧟9.11,p=0.000)。四組小鼠pod9時找到站臺潛伏期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(假手術(shù)組18.07±5.86s,缺血10min組26.64±9.37s,缺血30min組33.44±6.65s,缺血60min組41.90±4.52s,f=17.52,p=0.000),四組小鼠空間探索試驗?zāi)繕?biāo)象限活動時間存在差異(假手術(shù)組26.15±6.02s,缺血10min組22.08±3.49s,缺血30min組20.67±3.53s,缺血60min組12.22±2.26,f=16.63,p=0.000),與假手術(shù)組相比,缺血10min組目標(biāo)象限活動時間下降不明顯(p0.05),缺血30分鐘組、缺血60分鐘組減少(p0.05)。mbp免疫組化染色結(jié)果:四組小鼠mbp染色積分光密度值(integratedopticaldensity,iod)與假手術(shù)組平均iod比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(假手術(shù)組1.00±0.07,缺血10min組0.71±0.08,缺血30min組0.53±0.08,缺血60min組0.29±0.13,f=82.28,p=0.000),與假手術(shù)組相比,缺血10min組、缺血30min組、缺血60min組mbp染色iod與假手術(shù)組平均iod比值減少(p0.05)。lfb染色結(jié)果提示:四組小鼠lfb染色iod與假手術(shù)組平均iod比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(假手術(shù)組1.00±0.32,缺血10min組0.82±0.16,缺血30min組0.62±0.12,缺血60min組0.40±0.19,f=12.16,p=0.000),與假手術(shù)組相比,缺血10min組減少不顯著(p0.05),缺血30min組、缺血60min組減少(p0.05)。gst-pi免疫組化染色結(jié)果:四組小鼠gst-pi陽性細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(假手術(shù)組23.02±4.83/mm~2,缺血10min組21.01±2.14/mm~2,缺血30min組18.08±2.01/mm~2,缺血60min組15.03±1.66/mm~2,f=11.22,p=0.000),與假手術(shù)組相比,缺血10min組gst-pi陽性細胞數(shù)無明顯差異(p0.05),缺血30min組、缺血60min組gst-pi陽性細胞數(shù)均減少(p0.05)。第二部分:血管性認知障礙小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞極化的研究與假手術(shù)組小鼠相比,vci組小鼠海馬勻漿的cd11biod與內(nèi)參iod比值明顯增加(假手術(shù)組0.21±0.11,vci-15d組0.61±0.17,t=㧟5.66,p=0.000)。四組小鼠海馬勻漿inos條帶iod與內(nèi)參iod比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(假手術(shù)組1.04±0.13,vci-24h組0.99±0.09,vci-7d組1.13±0.08,vci-15d組1.17±0.17,f=3.37,p=0.032),與假手術(shù)組相比,vci-24h組inos條帶iod與內(nèi)參iod比值減少不顯著(p0.05)vci-7d組、vci-15d組inos條帶iod與內(nèi)參iod比值有所增加,但不顯著(p0.05),但vci-15d組inos條帶iod與內(nèi)參iod比值較vci-24h組增加且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。四組小鼠海馬勻漿arg-1條帶iod與內(nèi)參iod比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(假手術(shù)組0.82±0.08,vci-24h組0.96±0.14,vci-7d組0.94±0.11,vci-15d組0.64±0.26,f=6.35,p=0.002),與假手術(shù)組相比,vci-24h組、vci-7d組arg-1條帶iod與內(nèi)參iod比值增加不顯著(p0.05),vci-15d組arg-1條帶iod與內(nèi)參iod比值明顯降低(p0.05)。免疫熒光染色結(jié)果:與假手術(shù)組相比,VCI-15d組CD11b/i NOS雙染陽性細胞數(shù)量增加,具有統(tǒng)計學(xué)差異(假手術(shù)組15.66±0.78/mm~2,VCI-15d組22.11±2.27/mm~2,t=㧟7.62,P=0.000)。與假手術(shù)組相比,VCI-15d組Arg-1陽性細胞數(shù)量減少,具有統(tǒng)計學(xué)差異(假手術(shù)組19.18±2.45/mm~2,VCI-15d組12.18±2.16/mm~2,t=6.06,P=0.000)。Fractalkine/CX3CR1信號通路蛋白免疫印跡結(jié)果:與假手術(shù)組相比,VCI-15d組小鼠海馬勻漿中CX3CL1條帶IOD與內(nèi)參IOD比值上升(假手術(shù)組0.23±0.12,VCI-15d組0.47±0.22,t=㧟2.83,P=0.013),VCI-15d組小鼠海馬勻漿中CX3CR1條帶IOD與內(nèi)參IOD比值上升(假手術(shù)組0.32±0.11,VCI-15d組0.45±0.10,t=㧟2.60,P=0.021),VCI-15d組核轉(zhuǎn)錄因子κB-p50(Nuclear Factor-Kappa B,NF-κB)條帶IOD與內(nèi)參IOD比值明顯增加(假手術(shù)組0.46±0.14,VCI-15d組0.78±0.12,t=㧟5.01,P=0.000),VCI-15d組環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP Response Element-Binding Protein,CREB)條帶IOD與內(nèi)參IOD比值增加不顯著(假手術(shù)組0.11±0.05,VCI-15d組0.13±0.09,t=㧟0.60,P=0.56)。結(jié)論通過調(diào)控雙側(cè)頸動脈不同缺血時間建立并比較不同缺血時間的血管性認知障礙小鼠模型,證明短暫性腦缺血即可出現(xiàn)少突膠質(zhì)細胞及髓鞘損傷,以及認知功能障礙。然而缺血60分鐘所致?lián)p傷更為明顯、穩(wěn)定,是研究小膠質(zhì)細胞極化的合適模型。通過對VCI模型的小膠質(zhì)細胞激活情況的觀察,小膠質(zhì)細胞向M1型與M2型極化方向的研究,以及對Fractalkine/CX3CR1信號通路的研究,表明在腦缺血情況下,VCI動物腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞激活,主要為M1型,Fractalkine/CX3CR1信號通路激活,主要向NF-κB方向?qū)е翸1型激活,從而引起促炎反應(yīng)導(dǎo)致髓鞘損傷。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.13

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李海龍;鄭惠文;劉敏;黎佳思;王云霞;趙善民;畢曉瑩;;血管性認知障礙小鼠腦內(nèi)少突膠質(zhì)細胞再生分化障礙特點研究[J];中國卒中雜志;2015年11期

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本文編號：1150388