本文關(guān)鍵詞：CLU-His蛋白對(duì)Aβ寡聚化影響的單分子動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)俗稱老年性癡呆,作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的神經(jīng)退行性疾病,以細(xì)胞外老年斑(Senile plaques, SPs)和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles, NFTs)為主要病理特征。以Aβ的胞外聚集為核心的Ap假說仍是當(dāng)前公認(rèn)度最高的AD發(fā)病機(jī)制學(xué)說,其中Ap寡聚體,被認(rèn)為是主要的致病因子。Clusterin蛋白作為Ap的胞外分子伴侶,在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均已被證實(shí)與Ap有直接相互作用關(guān)系,但二者之間相互作用機(jī)制尚不明確,且目前報(bào)道的研究結(jié)果也多有矛盾觀點(diǎn)。因此,研究clusterin與Ap寡聚體間的相互作用并探討其作用機(jī)制,對(duì)進(jìn)一步揭示AD的發(fā)病機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的臨床干預(yù)措施都有重要意義。雙色熒光交叉關(guān)聯(lián)光譜(Dual color-fluorescence cross correlation spectroscopy, DC-FCCS)是通過測(cè)量熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的漲落而進(jìn)行分析檢測(cè)的單分子熒光檢測(cè)技術(shù)。DC-FCCS可檢測(cè)兩種不同的熒光組分,非常適合于生物大分子間相互作用的研究,應(yīng)用DC-FCCS技術(shù)在單分子層面探討clusterin與Ap寡聚體間的相互作用機(jī)制研究是我們首次提出。在本論文中,我們建立了相較于前期工作更為簡(jiǎn)單的熒光檢測(cè)平臺(tái),構(gòu)建了不攜帶熒光標(biāo)簽的CLU-His蛋白,并且CLU-His蛋白也無需體外熒光標(biāo)記,只需將CLU-His蛋白與兩種不同熒光標(biāo)記的Aβ4z單體孵育,即可采用DC-FCCS技術(shù)對(duì)CLU-His與Aβ4z間相互作用的動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行觀察。本論文采用Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行CLU-His蛋白的真核表達(dá),擴(kuò)增clusterin編碼序列,然后將其連接到pFastBacl載體上,并在C端連接His標(biāo)簽編碼序列,獲得pFastBacl-CLU-HIs質(zhì)粒；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli DH10Bac感受態(tài)獲得重組DNA分子rBacmid-CLU-His；之后將rBacmid-CLU-His轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,包裝病毒并擴(kuò)增,過表達(dá)CLU-His蛋白；CLU-His蛋白經(jīng)鎳柱和凝膠過濾兩步柱層析純化后,與分別標(biāo)記Bodipy FL和ATTO 647N兩種熒光染料的Aβ42單體,共同孵育,應(yīng)用DC-FCCS監(jiān)測(cè)CLU-His與Aβ42間相互作用的動(dòng)力學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Aβ42寡聚體和CLU-His之間有直接的相互作用；并且隨著時(shí)間推移,二者的結(jié)合效率均逐漸增強(qiáng)；CLU-His對(duì)Aβ42寡聚體的形成具有明顯的促進(jìn)作用。本論文建立的熒光檢測(cè)平臺(tái),不僅能夠用于不攜帶熒光標(biāo)簽及無需體外熒光標(biāo)記蛋白與Aβ42寡聚體間的相互作用研究,而且為探索AD的發(fā)病機(jī)制、藥物靶標(biāo)篩選、臨床診斷及治療研究提供更多的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16

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8 吳，

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