本文關鍵詞：博爾納病毒感染人少突膠質細胞的蛋白質組學和乙酰化修飾組學研究

  更多相關文章： 博爾納病毒 少突膠質瘤細胞 組蛋白 蛋白質組學 乙�；揎椊M學

【摘要】：背景 博爾納病毒（Borna disease virus，BDV）是一種有包膜的單股負鏈非節(jié)段性RNA病毒，具有高度嗜神經(jīng)性，能夠感染包括人類在內的多種溫血動物。近30年來在世界范圍內開展了BDV的流行病學調查。盡管有大量流行病學數(shù)據(jù)顯示BDV感染與抑郁、精神分裂癥等人類精神疾病緊密相關，但是BDV感染與人類精神疾病的關聯(lián)仍然存在巨大的爭議，其主要原因在于BDV感染的致病機制仍不十分清晰，二者之間關聯(lián)的直接證據(jù)尚不充分。隨著定量質譜技術的發(fā)展，病毒蛋白質組學、翻譯后修飾蛋白質組學對于探索病毒與宿主之間的互作關系和病毒致病機制正在發(fā)揮著日益重要的作用。BDV感染后宿主細胞的蛋白質組學改變及乙�；揎椄淖兊臄�(shù)據(jù)十分有限，限制了從組學及修飾組學角度對BDV致病機制的理解。 目的 1.運用2種蛋白質組學的方法（雙向凝膠電泳分離結合質譜鑒定技術（2D-MS），基于SILAC的定量蛋白質組學技術）鑒定正常和BDV感染的OL細胞的差異蛋白質表達，探討B(tài)DV的可能致病機制。 2.應用基于SILAC技術、抗體IP技術的定量蛋白質組學研究對正常和BDV感染的OL細胞的組蛋白乙�；鞍投辊；稽c進行鑒定和相對定量分析。 3.應用基于SILAC技術、抗體IP技術的定量蛋白質組學研究對正常和BDV感染的OL細胞進行蛋白質乙酰化修飾鑒定和相對定量分析，從差異乙酰化蛋白分析BDV的可能致病機制。 方法 1.構建及培養(yǎng)正常和BDV感染的OL細胞，采用2D-MS鑒定BDV感染相關的差異蛋白表達，運用Western blotting技術驗證部分差異蛋白，應用CCK檢測及細胞免疫熒光技術進一步探索BDV感染對細胞增殖和pERK1/2蛋白細胞核內表達的影響。 2.采用SILAC技術培養(yǎng)正常和BDV感染OL細胞，細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)6代后，，提取正常和BDV感染的OL細胞的總蛋白和組蛋白。在定量蛋白質組學、組蛋白乙�；b定和全蛋白組乙酰化鑒定這3個不同的實驗中，分別將各組輕重同位素標記的樣品等量混合，胰蛋白酶法酶解混合蛋白，用HPLC將混合蛋白分為多個組分。采用IP技術，用廣譜賴氨酸乙�；悸�(lián)富集乙�；亩�。用LC-ESI-MS/MS檢測蛋白質或富集的乙酰化肽段。組蛋白巴豆酰化修飾鑒定采用同樣的方法。 3.經(jīng)過生物信息學分析，探討B(tài)DV感染對OL細胞的蛋白質組的影響，對OL細胞組蛋白、非組蛋白乙�；揎椀挠绊�，進一步探索其可能的致病機制。 結果 1.應用2D-MS在正常和BDV感染OL細胞中共鑒定到63個差異蛋白。KEGG分析提示差異蛋白顯著富集在戊糖磷酸途徑，乙醛酸和二羧酸酯代謝，三羧酸循環(huán)，糖酵解/糖異生等能量代謝通路。通過手動查詢，發(fā)現(xiàn)2個差異蛋白（CrkL，PEBP-1）與MAPK信號通路相關，進而用Western blotting驗證了該途徑的5個關鍵蛋白（p-Raf, p-MEK,p-ERK1/2, p-RSK, and p-MSK）。BDV感染導致p-ERK1/2和p-RSK顯著上調，p-MSK顯著下調。雖然BDV感染激活了ERK-RSK途徑，但是OL細胞的增殖和p-ERK1/2在BDV感染的OL細胞的核內表達均受損。 2.通過基于SILAC技術的定量蛋白質組學分析，在正常及BDV感染的OL細胞中鑒定到4383個可定量的非冗余蛋白及30個組蛋白乙�；稽c。生物信息學分析提示BDV感染后的差異蛋白富集在多種生物功能及通路上，包括代謝通路、免疫反應、DNA復制、修復及轉錄調控。此外，一些關鍵的組蛋白乙酰轉移酶和去乙�；冈贐DV感染后發(fā)生了顯著的改變。BDV感染后15個組蛋白賴氨酸位點乙�；揎楋@著下調，其中部分結果用位點特異性乙�；贵w進行了Westernblotting驗證。 3.通過基于SILAC、IP技術的定量蛋白質組學分析，在正常及BDV感染的OL細胞中鑒定到791個可定量的非冗余賴氨酸乙�；稽c，這些位點位于473個可以定量的蛋白中。生物信息學分析提示鑒定到的乙�；鞍罪@著富集在代謝通路上，包括丁酸酯代謝，β-丙氨酸的代謝，色氨酸代謝和脂肪酸代謝。GO分析顯示BDV感染后乙�；牡孜镲@著富集于細胞膜和線粒體，與跨膜轉運活性密切相關。此外，BDV感染引起多種組蛋白乙酰轉移酶的賴氨酸乙�；揎椄淖�。 4.初步鑒定到部分組蛋白巴豆酰化位點。 結論 1. BDV感染引起OL細胞的能量代謝相關蛋白改變。OL細胞中的BDV感染激活了ERK-RSK復合物，但是OL細胞的存活并未因此上調，反而下降，實驗中所觀察到的pERK核內表達受損可能是這一現(xiàn)象的重要原因。 2.本研究在神經(jīng)膠質細胞中進行了定量蛋白質組學分析，并提示BDV感染影響了代謝通路、免疫反應、DNA復制、修復及轉錄調控。本研究首次鑒定了組蛋白賴氨酸乙酰化位點。通過探討B(tài)DV感染引起蛋白質組及組蛋白賴氨酸乙�；淖冎g的關聯(lián)，可以加深我們對BDV感染致病機制的了解。 3.本研究在BDV感染的神經(jīng)膠質細胞中首次進行了乙�；揎椂康鞍踪|組學分析，發(fā)現(xiàn)BDV感染后發(fā)生改變的乙�；鞍赘患诖x通路上，提示BDV感染通過乙�；揎椪{控宿主細胞代謝通路，進一步證實了代謝改變在BDV致病作用中的重要性。 4. BDV感染可能調節(jié)組蛋白巴豆�；揎棥�
【關鍵詞】：博爾納病毒 少突膠質瘤細胞 組蛋白 蛋白質組學 乙�；揎椊M學
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-10
• 摘要10-14
• ABSTRACT14-19
• 前言19-27
• 參考文獻22-27
• 第一部分 博爾納病毒感染人少突膠質細胞的基于雙向凝膠電泳-質譜技術的蛋白質組學研究27-60
• 前言27
• 1 材料與方法27-40
• 2 結果40-52
• 3 討論52-56
• 4 小結56-57
• 參考文獻57-60
• 第二部分 博爾納病毒感染人少突膠質細胞的定量蛋白質組學研究及組蛋白乙�；揎楄b定60-87
• 前言60
• 1 材料與方法60-66
• 2 結果66-78
• 3 討論78-83
• 4 小結83-84
• 參考文獻84-87
• 第三部分 博爾納病毒感染人少突膠質細胞的乙�；鞍踪|組學研究87-102
• 前言87
• 1 材料與方法87-88
• 2 結果88-96
• 3 討論96-99
• 4 小結99-100
• 參考文獻100-102
• 第四部分 新型修飾組蛋白巴豆酰化鑒定初探102-111
• 前言102
• 1 材料與方法102-103
• 2 結果103-107
• 3 討論107-109
• 4 小結109-110
• 參考文獻110-111
• 全文總結111-113
• 文獻綜述113-124
• 參考文獻120-124
• 致謝124-126
• 攻讀博士期間發(fā)表論文及參加會議126-129

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Viral proteomics: The emerging cutting-edge of virus research[J];Science China(Life Sciences);2011年06期

本文編號：1033871