本文關(guān)鍵詞：博爾納病毒感染人少突膠質(zhì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)和乙�；揎椊M學(xué)研究

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【摘要】：背景 博爾納病毒（Borna disease virus，BDV）是一種有包膜的單股負(fù)鏈非節(jié)段性RNA病毒，具有高度嗜神經(jīng)性，能夠感染包括人類在內(nèi)的多種溫血?jiǎng)游铩＝?0年來(lái)在世界范圍內(nèi)開(kāi)展了BDV的流行病學(xué)調(diào)查。盡管有大量流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示BDV感染與抑郁、精神分裂癥等人類精神疾病緊密相關(guān)，但是BDV感染與人類精神疾病的關(guān)聯(lián)仍然存在巨大的爭(zhēng)議，其主要原因在于BDV感染的致病機(jī)制仍不十分清晰，二者之間關(guān)聯(lián)的直接證據(jù)尚不充分。隨著定量質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，病毒蛋白質(zhì)組學(xué)、翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)于探索病毒與宿主之間的互作關(guān)系和病毒致病機(jī)制正在發(fā)揮著日益重要的作用。BDV感染后宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)改變及乙�；揎椄淖兊臄�(shù)據(jù)十分有限，限制了從組學(xué)及修飾組學(xué)角度對(duì)BDV致病機(jī)制的理解。 目的 1.運(yùn)用2種蛋白質(zhì)組學(xué)的方法（雙向凝膠電泳分離結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)（2D-MS），基于SILAC的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)）鑒定正常和BDV感染的OL細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)表達(dá)，探討B(tài)DV的可能致病機(jī)制。 2.應(yīng)用基于SILAC技術(shù)、抗體IP技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)正常和BDV感染的OL細(xì)胞的組蛋白乙�；鞍投辊；稽c(diǎn)進(jìn)行鑒定和相對(duì)定量分析。 3.應(yīng)用基于SILAC技術(shù)、抗體IP技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)正常和BDV感染的OL細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)乙�；揎楄b定和相對(duì)定量分析，從差異乙�；鞍追治鯞DV的可能致病機(jī)制。 方法 1.構(gòu)建及培養(yǎng)正常和BDV感染的OL細(xì)胞，采用2D-MS鑒定BDV感染相關(guān)的差異蛋白表達(dá)，運(yùn)用Western blotting技術(shù)驗(yàn)證部分差異蛋白，應(yīng)用CCK檢測(cè)及細(xì)胞免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步探索BDV感染對(duì)細(xì)胞增殖和pERK1/2蛋白細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的影響。 2.采用SILAC技術(shù)培養(yǎng)正常和BDV感染OL細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)6代后，，提取正常和BDV感染的OL細(xì)胞的總蛋白和組蛋白。在定量蛋白質(zhì)組學(xué)、組蛋白乙酰化鑒定和全蛋白組乙�；b定這3個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)中，分別將各組輕重同位素標(biāo)記的樣品等量混合，胰蛋白酶法酶解混合蛋白，用HPLC將混合蛋白分為多個(gè)組分。采用IP技術(shù)，用廣譜賴氨酸乙�；悸�(lián)富集乙�；亩�。用LC-ESI-MS/MS檢測(cè)蛋白質(zhì)或富集的乙�；亩巍＝M蛋白巴豆�；揎楄b定采用同樣的方法。 3.經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，探討B(tài)DV感染對(duì)OL細(xì)胞的蛋白質(zhì)組的影響，對(duì)OL細(xì)胞組蛋白、非組蛋白乙�；揎椀挠绊�，進(jìn)一步探索其可能的致病機(jī)制。 結(jié)果 1.應(yīng)用2D-MS在正常和BDV感染OL細(xì)胞中共鑒定到63個(gè)差異蛋白。KEGG分析提示差異蛋白顯著富集在戊糖磷酸途徑，乙醛酸和二羧酸酯代謝，三羧酸循環(huán)，糖酵解/糖異生等能量代謝通路。通過(guò)手動(dòng)查詢，發(fā)現(xiàn)2個(gè)差異蛋白（CrkL，PEBP-1）與MAPK信號(hào)通路相關(guān)，進(jìn)而用Western blotting驗(yàn)證了該途徑的5個(gè)關(guān)鍵蛋白（p-Raf, p-MEK,p-ERK1/2, p-RSK, and p-MSK）。BDV感染導(dǎo)致p-ERK1/2和p-RSK顯著上調(diào)，p-MSK顯著下調(diào)。雖然BDV感染激活了ERK-RSK途徑，但是OL細(xì)胞的增殖和p-ERK1/2在BDV感染的OL細(xì)胞的核內(nèi)表達(dá)均受損。 2.通過(guò)基于SILAC技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在正常及BDV感染的OL細(xì)胞中鑒定到4383個(gè)可定量的非冗余蛋白及30個(gè)組蛋白乙�；稽c(diǎn)。生物信息學(xué)分析提示BDV感染后的差異蛋白富集在多種生物功能及通路上，包括代謝通路、免疫反應(yīng)、DNA復(fù)制、修復(fù)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，一些關(guān)鍵的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙�；冈贐DV感染后發(fā)生了顯著的改變。BDV感染后15個(gè)組蛋白賴氨酸位點(diǎn)乙�；揎楋@著下調(diào)，其中部分結(jié)果用位點(diǎn)特異性乙酰化抗體進(jìn)行了Westernblotting驗(yàn)證。 3.通過(guò)基于SILAC、IP技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在正常及BDV感染的OL細(xì)胞中鑒定到791個(gè)可定量的非冗余賴氨酸乙�；稽c(diǎn)，這些位點(diǎn)位于473個(gè)可以定量的蛋白中。生物信息學(xué)分析提示鑒定到的乙�；鞍罪@著富集在代謝通路上，包括丁酸酯代謝，β-丙氨酸的代謝，色氨酸代謝和脂肪酸代謝。GO分析顯示BDV感染后乙�；牡孜镲@著富集于細(xì)胞膜和線粒體，與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性密切相關(guān)。此外，BDV感染引起多種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的賴氨酸乙酰化修飾改變。 4.初步鑒定到部分組蛋白巴豆�；稽c(diǎn)。 結(jié)論 1. BDV感染引起OL細(xì)胞的能量代謝相關(guān)蛋白改變。OL細(xì)胞中的BDV感染激活了ERK-RSK復(fù)合物，但是OL細(xì)胞的存活并未因此上調(diào)，反而下降，實(shí)驗(yàn)中所觀察到的pERK核內(nèi)表達(dá)受損可能是這一現(xiàn)象的重要原因。 2.本研究在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并提示BDV感染影響了代謝通路、免疫反應(yīng)、DNA復(fù)制、修復(fù)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究首次鑒定了組蛋白賴氨酸乙�；稽c(diǎn)。通過(guò)探討B(tài)DV感染引起蛋白質(zhì)組及組蛋白賴氨酸乙�；淖冎g的關(guān)聯(lián)，可以加深我們對(duì)BDV感染致病機(jī)制的了解。 3.本研究在BDV感染的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中首次進(jìn)行了乙�；揎椂康鞍踪|(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)BDV感染后發(fā)生改變的乙�；鞍赘患诖x通路上，提示BDV感染通過(guò)乙�；揎椪{(diào)控宿主細(xì)胞代謝通路，進(jìn)一步證實(shí)了代謝改變?cè)贐DV致病作用中的重要性。 4. BDV感染可能調(diào)節(jié)組蛋白巴豆�；揎�。
【關(guān)鍵詞】：博爾納病毒 少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞 組蛋白 蛋白質(zhì)組學(xué) 乙�；揎椊M學(xué)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照6-10
• 摘要10-14
• ABSTRACT14-19
• 前言19-27
• 參考文獻(xiàn)22-27
• 第一部分 博爾納病毒感染人少突膠質(zhì)細(xì)胞的基于雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究27-60
• 前言27
• 1 材料與方法27-40
• 2 結(jié)果40-52
• 3 討論52-56
• 4 小結(jié)56-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 第二部分 博爾納病毒感染人少突膠質(zhì)細(xì)胞的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究及組蛋白乙�；揎楄b定60-87
• 前言60
• 1 材料與方法60-66
• 2 結(jié)果66-78
• 3 討論78-83
• 4 小結(jié)83-84
• 參考文獻(xiàn)84-87
• 第三部分 博爾納病毒感染人少突膠質(zhì)細(xì)胞的乙�；鞍踪|(zhì)組學(xué)研究87-102
• 前言87
• 1 材料與方法87-88
• 2 結(jié)果88-96
• 3 討論96-99
• 4 小結(jié)99-100
• 參考文獻(xiàn)100-102
• 第四部分 新型修飾組蛋白巴豆酰化鑒定初探102-111
• 前言102
• 1 材料與方法102-103
• 2 結(jié)果103-107
• 3 討論107-109
• 4 小結(jié)109-110
• 參考文獻(xiàn)110-111
• 全文總結(jié)111-113
• 文獻(xiàn)綜述113-124
• 參考文獻(xiàn)120-124
• 致謝124-126
• 攻讀博士期間發(fā)表論文及參加會(huì)議126-129

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Viral proteomics: The emerging cutting-edge of virus research[J];Science China(Life Sciences);2011年06期

本文編號(hào)：1033871