本文關(guān)鍵詞：通心絡(luò)改善缺氧性腦損傷的作用機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 通心絡(luò) 缺氧 緊密連接蛋白 KLF4 KLF4磷酸化

【摘要】：目的:通心絡(luò)對(duì)缺血缺氧性腦損傷具有保護(hù)作用,但其作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究在動(dòng)物模型和細(xì)胞水平上研究通心絡(luò)對(duì)腦組織微血管缺氧性損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制,為通心絡(luò)用于防治缺血性腦損傷提供理論依據(jù)。方法:選取雄性C57BL/6J小鼠,利用低壓氧艙制備缺氧性腦損傷動(dòng)物模型,給予通心絡(luò)灌胃處理后,冰凍切片觀察腦組織微血管內(nèi)皮緊密連接蛋白表達(dá),CD31免疫熒光染色對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行染色定位;在細(xì)胞水平上,將體外培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞與通心絡(luò)預(yù)孵育,利用密封缺氧罐使細(xì)胞缺氧,取細(xì)胞爬片進(jìn)行緊密連接蛋白免疫熒光染色。利用Western blot分析檢測(cè)緊密連接蛋白的表達(dá)變化。利用脂質(zhì)體將不同磷酸化位點(diǎn)突變的KLF4質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),檢測(cè)對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1通心絡(luò)通過(guò)增加血管內(nèi)皮緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表達(dá)改善缺氧性腦損傷。CD31與VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的免疫熒光雙染色結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,通心絡(luò)處理組的微血管緊密連接蛋白完整性好,內(nèi)皮染色更連續(xù)、線條更平滑。表明通心絡(luò)處理后腦組織微血管內(nèi)皮的緊密連接蛋白表達(dá)增加,血管內(nèi)皮完整性較好。缺氧組小鼠腦組織的微血管緊密連接蛋白表達(dá)顯著降低,導(dǎo)致微血管緊密連接出現(xiàn)殘缺,表明缺氧導(dǎo)致了微血管損傷;缺氧動(dòng)物給予通心絡(luò)處理后,逆轉(zhuǎn)了小鼠腦組織微血管的緊密連接蛋白表達(dá),內(nèi)皮細(xì)胞緊密排布,血管內(nèi)皮完整性增強(qiáng)。以上結(jié)果顯示,通心絡(luò)可以促進(jìn)小鼠腦組織微血管緊密連接蛋白的表達(dá)。Western blot分析結(jié)果顯示,與未經(jīng)通心絡(luò)處理的小鼠相比,通心絡(luò)處理組緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin的表達(dá)均有所增高,同時(shí)KLF4的表達(dá)也明顯上調(diào)。以上結(jié)果表明,通心絡(luò)通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin和ZO-1的表達(dá),進(jìn)而緩解缺氧對(duì)小鼠腦組織的損傷。2在缺氧條件下,通心絡(luò)能促進(jìn)體外培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VE-cadherin、β-catenin和ZO-1。體外培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞,取細(xì)胞爬片對(duì)緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin和ZO-1進(jìn)行免疫熒光染色。與對(duì)照組相比,通心絡(luò)處理組的內(nèi)皮細(xì)胞周圍的染色亮度較強(qiáng),表明通心絡(luò)可以促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)。細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后,緊密連接蛋白表達(dá)明顯降低;通心絡(luò)預(yù)孵育可逆轉(zhuǎn)缺氧對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)的抑制作用。Western blot分析結(jié)果顯示,與未經(jīng)通心絡(luò)處理的細(xì)胞相比,通心絡(luò)處理組細(xì)胞的緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1表達(dá)均增高,KLF4的表達(dá)水平也明顯升高。3通心絡(luò)通過(guò)促進(jìn)KLF4磷酸化上調(diào)緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表達(dá)。為了確定通心絡(luò)誘導(dǎo)緊密連接蛋白表達(dá)與KLF4磷酸化修飾之間的關(guān)系,利用免疫共沉淀檢測(cè)通心絡(luò)對(duì)KLF4磷酸化修飾的影響。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,通心絡(luò)處理組的KLF4磷酸化水平增高,變化趨勢(shì)與緊密連接蛋白變化相一致。表明通心絡(luò)是通過(guò)促進(jìn)KLF4磷酸化來(lái)促進(jìn)VE-cadherin、β-catenin、ZO-1表達(dá)的。4通心絡(luò)通過(guò)促進(jìn)KLF4分子中S444和S415的磷酸化上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)。用不同的KLF4絲氨酸位點(diǎn)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染微血管內(nèi)皮細(xì)胞,觀察其對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染野生型GFP-KLF4和GFP-S444A、GFP-S415A點(diǎn)突變質(zhì)粒組,血管內(nèi)皮緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表達(dá)均低于轉(zhuǎn)染GFP-N1空載體組;而轉(zhuǎn)染GFP-S470A點(diǎn)突變質(zhì)粒組,細(xì)胞內(nèi)三種緊密連接蛋白的表達(dá)與GFP-N1組相比無(wú)明顯差異。內(nèi)皮細(xì)胞與通心絡(luò)預(yù)孵育24 h,再用KLF4絲氨酸位點(diǎn)突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后給預(yù)缺氧刺激12 h。Western blot分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,通心絡(luò)孵育的內(nèi)皮細(xì)胞中KLF4表達(dá)顯著提高,緊密連接蛋白表達(dá)也同時(shí)上調(diào);與野生型GFP-KLF4相比,在轉(zhuǎn)染GFP-S470A的細(xì)胞中緊密連接蛋白表達(dá)沒有明顯變化;在轉(zhuǎn)染GFP-S444A、GFP-S415A的細(xì)胞中,緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表達(dá)顯著下降。5通心絡(luò)通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)途徑促進(jìn)KLF4磷酸化。對(duì)從腦組織和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot分析,結(jié)果顯示,通心絡(luò)處理可使AKT磷酸化水平明顯增加。體外培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞與AKT抑制劑共孵育后,再檢測(cè)KLF4磷酸化修飾狀態(tài),結(jié)果顯示,與單純通心絡(luò)處理組相比,給予AKT抑制劑后再用通心絡(luò)處理的細(xì)胞,KLF4的磷酸化水平降低。結(jié)論:1通心絡(luò)對(duì)缺氧性腦損傷具有保護(hù)作用;2通心絡(luò)增加微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá);3通心絡(luò)通過(guò)促進(jìn)KLF4磷酸化上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá);4通心絡(luò)促進(jìn)KLF4分子中S444和S415位點(diǎn)的磷酸化;5通心絡(luò)通過(guò)激活A(yù)KT信號(hào)途徑誘導(dǎo)KLF4磷酸化。
【關(guān)鍵詞】：通心絡(luò) 缺氧 緊密連接蛋白 KLF4 KLF4磷酸化
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.15
【目錄】：

• 摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-17
• 結(jié)果17-20
• 附圖20-25
• 討論25-28
• 結(jié)論28
• 參考文獻(xiàn)28-31
• 綜述 血管內(nèi)皮生物學(xué)功能研究新進(jìn)展31-40
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 致謝40-41
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷41

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 杜子春;;通心絡(luò)膠囊輔治短暫性腦缺血發(fā)作合并高黏血癥的療效觀察[J];臨床合理用藥雜志;2012年25期

2 錢孝賢;陳燕銘;劉勇;周彬;陳t，

本文編號(hào)：957060