本文關(guān)鍵詞：PTEN干擾促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)

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【摘要】：目的:觀察轉(zhuǎn)染PTEN干擾RNA(PTEN siRNA)對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達(dá)的影響,探討PTEN對肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及可能機(jī)制。方法:1.體外培養(yǎng)NR8383,將細(xì)胞分成兩組:對照組轉(zhuǎn)染Control siRNA,干擾組轉(zhuǎn)染PTEN si RNA,分別選取10nM、20nM、40nM濃度轉(zhuǎn)染24小時(shí),采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞中PTEN mRNA表達(dá),采用蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,選擇20nM為最佳實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染濃度。2.將NR8383細(xì)胞分成兩組:對照組轉(zhuǎn)染Control siRNA,干擾組轉(zhuǎn)染PTEN si RNA,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,兩組細(xì)胞分別用終濃度1μg/ml LPS刺激細(xì)胞6小時(shí),采用RT-qPCR檢測兩組細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA表達(dá),采用western blot檢測兩組細(xì)胞內(nèi)AKT磷酸化水平,采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果:1.與對照組比較,10nM、20nM和40nM干擾組PTEN mRNA表達(dá)分別下調(diào)至(0.33±0.01)倍(P0.01)、(0.23±0.01)倍(P0.01)、(0.21±0.01)倍(P0.01);PTEN蛋白表達(dá)分別下降至(0.30±0.03)倍(P0.01)、(0.14±0.02)倍(P0.01)、(0.10±0.02)倍(P0.01);在干擾組中,與10nM濃度比較,20nM、40nM濃度PTEN蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。20nM與40nM濃度比較,PTEN蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.08)。2.兩組細(xì)胞LPS刺激6小時(shí)后,與對照組比較,p-AKT/AKT蛋白比值從(0.26±0.02)表達(dá)上升至(0.52±0.03)倍(P0.01),干擾組細(xì)胞中TNF-αmRNA表達(dá)上調(diào)至(1.56±0.18)倍(P0.01)。Control si RNA+LPS對照組細(xì)胞上清液TNF-α蛋白表達(dá)量為1632.56±52.05pg/ml,PTEN siRNA+LPS干擾組細(xì)胞上清液TNF-α蛋白表達(dá)量為1834.07±57.00pg/ml(P0.05)。結(jié)論:轉(zhuǎn)染PTEN si RNA入NR8383細(xì)胞后,可上調(diào)AKT磷酸化水平,促進(jìn)LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá)。因此,我們推測PTEN可能通過PI3K-AKT通路參與調(diào)控LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：PTEN 干擾RNA 磷酸化AKT 肺泡巨噬細(xì)胞 腫瘤壞死因子-α
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 引言11-15
• 第2章 材料與方法15-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 2.1.1 細(xì)胞株15
• 2.1.2 主要試劑15-16
• 2.1.3 主要儀器與設(shè)備16-17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)器材、試劑和溶液的準(zhǔn)備17-20
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用品的處理17-18
• 2.2.2 去RNA酶處理18
• 2.2.3 Ham’s F-12K培養(yǎng)基的配制18
• 2.2.4 LPS溶液的配制18
• 2.2.5 PTEN si RNA及Control siRNA相關(guān)試劑的配制18-19
• 2.2.6 Western Blot相關(guān)試劑的配制19-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法20-32
• 2.3.1 NR8383的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存20
• 2.3.2 細(xì)胞處理及分組20-21
• 2.3.3 RNA提取、定量和質(zhì)量檢測21-23
• 2.3.4 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PTEN m RNA及TNF-αmRNA的表達(dá)23-25
• 2.3.5 Western blot檢測PTEN、p-AKT蛋白的表達(dá)變化25-28
• 2.3.6 ELISA檢測上清中TNF-α蛋白的表達(dá)28-31
• 2.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理31-32
• 第3章 結(jié)果32-39
• 3.1 細(xì)胞總RNA質(zhì)量和濃度測定32
• 3.2 RT-qPCR擴(kuò)增的特異性32-34
• 3.3 BCA蛋白定量34
• 3.4 SYBR Green I Real-Time qPCR檢測轉(zhuǎn)染PTEN siRNA、Control siRNA后細(xì)胞內(nèi)PTEN mRNA表達(dá)變化，，選擇最佳轉(zhuǎn)染濃度34-35
• 3.5 Western blot檢測轉(zhuǎn)染PTEN siRNA、Control si RNA后細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)變化，選擇最佳轉(zhuǎn)染濃度35-36
• 3.6 下調(diào)PTEN對NR8383細(xì)胞靶蛋白AKT磷酸化水平的影響36
• 3.7 下調(diào)PTEN后對NR8383細(xì)胞TNF-α mRNA相對表達(dá)的影響36-37
• 3.8 大鼠TNF-α蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖37
• 3.9 下調(diào)PTEN后對NR8383細(xì)胞上清液中TNF-α蛋白表達(dá)的影響37-39
• 第4章 討論39-43
• 第5章 結(jié)論與展望43-44
• 5.1 結(jié)論43
• 5.2 進(jìn)一步工作的方向43-44
• 致謝44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果49-50
• 綜述50-56
• 參考文獻(xiàn)54-56

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：776108